固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定牛奶中辛基酚和正辛基酚

王浩，李星，张文超，陈江龙，巴冬梅，冉令磊

（国家食品质量安全监督检验中心，北京 100094）

0 引言

辛基酚和正辛基酚是一种环境内分泌干扰物[1-2]，可引起生物的一些病变，甚至导致癌症[3-9]。环境中的辛基酚和正辛基酚易通过食物链在体内富集[10-11]。奶牛食用了污染的饲料后，牛奶中就可能会有辛基酚和正辛基酚残留。目前，测定辛基酚和正辛基酚的方法主要有气相色谱-质谱法[12-13]、液相色谱法[14-15]和液相色谱-质谱法等[16-19]。但液相色谱法易产生假阳性，气相色谱-质谱法前处理繁琐，不利于批量样品的快速筛查。液相色谱-质谱联用法对痕量残留物质强大的定性定量能力，符合当前食品检测追求的快速高效的要求。本研究建立高效液相色谱串联质谱法检测牛奶中辛基酚和正辛基酚，此方法前处理简单、灵敏度高，适用于牛奶中辛基酚和正辛基酚的准确测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 6470型串联三重四极杆质谱仪：配电喷雾源（ESI）和Agilent1290Ⅱ型液相色谱仪；GL-88型涡旋混合器；KQ-5200型超声波清洗仪；N-EVAP.TM112型氮吹仪。

辛基酚、正辛基酚、辛基酚-13C6、正辛基酚-D17标准品，w≥99%，Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇和氨水：均为HPLC级；牛奶样品，购于超市；实验用水为Milli-Q纯水仪制备的超纯水（≥18 MΩ·cm）；PRiME HLB固相萃取柱：200 mg/6cc，美国Waters公司。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取10.0 mg辛基酚、正辛基酚、辛基酚-13C6、正辛基酚-D17标准品（精确至0.1 mg），置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成浓度为100 mg/L的标准储备液，-18℃保存，保存期6个月。再分别准确吸取1.0 mL的标准和同位素储备液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成浓度为1.0 mg/L的中间液，-18℃保存，有效期3个月。检测时，根据需要配制成适当浓度的标准工作液。

1.3 样品前处理

称取1.00 g样品，精确至0.01 g，置于10 mL具塞比色管中，加入内标工作液20 μL，氨水乙腈（1∶9，体积比）定容至刻度，具塞后剧烈震摇片刻，超声提取10 min，吸取2 mL上清液，过PRiME HLB固相萃取柱，弃去前5滴，准确收集1.5 mL的净化液至1.5 mL的进样瓶中，氮气吹干，再用0.3 mL乙腈充分溶解后过0.22 μm有机滤膜，液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 色谱-质谱条件

液相色谱条件为色谱柱：安捷伦Poroshell 120 PFP色谱柱（2.0 mm×150 mm，5μm）；流速0.30 mL/min；柱温30℃；进样体积2 μL；流动相为甲醇和1‰氨水溶液（9∶1，体积比）。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；负离子模式扫描；多反应检测的检测方式；干燥气为N2；雾化气压力为275.8 kPa；干燥气温度为300℃；干燥气流速为5 L/min；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11 L/min；毛细管电压为3 500 V；定性离子对、定量离子对及碰撞能量如表1所示。

表1 化合物的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

辛基酚和正辛基酚易溶于乙醇、丙酮等有机试剂,且牛奶基质复杂，富含脂肪和蛋白质，因此分别比较了乙醇、乙腈、丙酮和氯仿去除样品中蛋白质的效果。实验发现乙腈去除蛋白的效果最好，如图1所示，因此选取乙腈为提取溶剂；辛基酚和正辛基酚都是负离子模式电离，为了提高离子化效率，本方法采用氨水乙腈(1∶9，体积比)提取样品；分别对比了PRiME HLB（6cc/200 mg）固相萃取柱、Oasis HLB（6cc/200 mg）固相萃取柱、安杰尔C18（6cc/200 mg）固相萃取柱、安杰尔PCX（6cc/200 mg）固相萃取柱的净化效果。通过实验发现，PRiME HLB（6cc/200 mg）固相萃取柱效果较好，其能吸附非极性干扰物质而不影响目标化合物的回收率，特别是对牛奶基质中脂肪和磷脂，去除效率高达95%以上；其余3种固相萃取柱均需要活化处理，而且提取液氮吹后会有油脂残留，因此选取PRiMEHLB（6cc/200 mg）固相萃取柱进行样品净化；为了提高目标化合物检测灵敏度，该方法采用氮吹进行富集，最终样品的稀释倍数为1.0。

图1 乙醇、乙腈、丙酮和氯仿去除蛋白效果图

表2 4种固相萃取柱的净化效果 %

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

本方法分别采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.8 μm）、资生堂MGⅢ-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm,5 μm）、AgilentPoroshell120PFP色谱柱（100mm×4.6mm，2.7μm)和HypersilGOLD C18色谱柱（50 mm×4.6 mm,1.9 μm）进行分离实验。实验发现，上述4款色谱柱均能有效分离辛基酚和正辛基酚，但AgilenPoroshell 120 PFP色谱柱（50 mm×4.6 mm,1.9 μm）比亚2微米柱减小了50%的压力，而且可以同时与0.4 MPa和0.6 MPa液相色谱相匹配，所以最终选择Agilent Poroshell 120 PFP色谱柱（50 mm×4.6 mm,1.9 μm）。

2.2.2 色谱分离条件选择

烷基酚类化合物自身结构中有烷基酚，流动相的酸碱度对于烷基酚类物质的电离效果有不同的影响。首先分析了以甲醇作为有机相时，不同酸度水相(1‰甲酸水、水、1‰氨水)对于辛基酚和正辛基酚的峰型及分离情况；以纯水为水相时辛基酚和正辛基酚的信号强度作为参考标准，当使用1‰甲酸溶液时，两个化合物信号基本消失，可能是因为质子会抑制两个化合物在离子源中的电离；当使用1‰氨水溶液时，辛基酚和正辛基酚的信号分别增强了55%和60%，因此选择1‰氨水作为水相。随后分析了以1‰氨水作为水相，比较甲醇和乙腈对BPA和BPS响应信号的影响。发现二者无明显差异，考虑到甲醇在色谱柱上有更好的分离效果，因此选用甲醇和1‰氨水溶液作为方法流动相。

为了提高检测效率，本方法使用的流动相为甲醇和1‰氨水溶液（9∶1，v/v）进行等度洗脱；在检测过程中，仪器运行的0～5 min进废液，5～7 min待测液再进质谱分析，这样既能去除测定液中强极性和中等极性的杂质，又能尽可能缩短质谱分析时间，同时保护质谱免受污染。实验发现，使用甲醇和1‰氨水溶液（9∶1，v/v）的流动相能在7 min内完成辛基酚和正辛基酚的有效分离。图2为辛基酚和正辛基酚的MRM色谱图。

图2 辛基酚和正辛基酚的MRM色谱图

2.2.3 进样量的选择

实验发现，当进样量为2 μL，可以满足方法的检出限和定量限，同时进样量少可以减少样品提取液中杂质污染色谱柱，从而延长色谱柱寿命，还可以减少杂质对质谱离子源的污染。

2.3 定量方法的选择

样品中除目标物以外的组分常常对目标物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。本实验通过比较目标化合物在牛奶中与纯溶剂中的标准曲线的斜率来评价辛基酚和正辛基酚的基质效应，当目标化合物在基质中与纯溶剂中的斜率比值小于1时，表明基质对其具有电离抑制作用；反之，则表明具有电离增强作用。实验发现，辛基酚和正辛基酚的基质效应分别为0.67和0.71，说明牛奶中的其它成分对这两种物质的测定造成电离抑制作用。因此有必要采用同位素内标法来弥补前处理过程中的差异对检测定量结果的影响，提高方法定量的准确性。本方法选择辛基酚-13C6和正辛基酚-D17做为相应的内标物质，采用内标法定量分析。

2.4 线性范围与检出限

配制标准系列混合工作液（辛基酚和正辛基酚质量浓度依次为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL，二者的内标质量浓度均为10.0 ng/mL）。以目标物的峰面积（y)对质量浓度（x）做标准曲线。同时选择空白样品，定量添加标准溶液，按照上述实验方法进行处理测定。当测试液所得谱图的信噪比大于3时，将此添加量定为最低检出限，当信噪比大于10，将此添加量定为最低定量限，结果如表3所示。

表3 辛基酚和正辛基酚的线性方程、线性关系、相关系数、定量限及检出限

2.5 方法的回收率和精密度

准确称取空白样品18份，每份1.0 g，平均分为3组，分别定量加入目标化合物的标准物质。第一组添加水平：辛基酚和正辛基酚均为2.0 μg/kg；第二组添加水平：辛基酚和正辛基酚均为4.0 μg/kg；第三组添加水平：辛基酚和正辛基酚均为10.0 μg/kg。

按上述实验方法提取后进行测定，测定结果如表4所示。由表4可以看出，辛基酚和正辛基酚不同浓度平均加标回收率在88.1%～100.4%之间，平均相对标准偏差为3.48%～7.29%（n=6）。

表4 辛基酚和正辛基酚的加标回收率

2.6 实际样品检测

按照上述实验方法对市场中销售的10种牛奶样品（包括脱脂奶、全脂奶、调制奶和儿童牛奶等）进行处理并检测，辛基酚和正辛基酚均未检出。牛宇敏等建立了同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定动物性食品中的双酚A、壬基酚及辛基酚，此方法中辛基酚的检出限为0.4 μg/kg，且液体奶样品中辛基酚未检出，参照此方法对上述的10种牛奶进行测定，辛基酚和正辛基酚均未检出。上述结果表明，我国牛奶市场无辛基酚和正辛基酚普遍残留的现象。

3 结论

本研究建立了使用液相色谱-串联质谱同时测定牛奶中辛基酚和正辛基酚残留的方法。该方法的样品前处理简单易行、分析快速，回收率高，定量限及精密度均能满足残留检测要求，能为我国牛奶中辛基酚和正辛基酚污染物残留的监管与乳品生产企业质控提供技术支撑。