含有后生元和β-葡聚糖的乳饮料对小鼠免疫功能的影响

康宇鸿，何剑，赵六永，任新志，刘枫，郝靖宇，夏锐，李沙，田丽，杨华，阴文娅

（1.四川大学华西公共卫生学院华西第四医院 成都 610044；2.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，呼和浩特 010110）

0 引言

免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统。由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调，共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能，免疫功能紊乱或者低下会使机体更容易受到病原体的侵害，从而增加患病风险[1]。机体可以通过先天免疫和适应性免疫两种方式来识别和消灭入侵的病原微生物。

益生菌在免疫调节方面有积极作用[2-4]。功能食品和其他发酵产品中最常用的益生菌包括乳酸杆菌、双歧杆菌和明串珠菌属等[5]。益生菌的效能取决于活菌数以及肠道定殖效率，然而，在工业生产中，与食物基质有关的一些因素，如酸碱度、蛋白质、脂肪和碳水化合物浓度等，加工和储存条件如时间、温度、包装材料等因素都可能降低益生菌细胞的生存能力[6]。相比之下，后生元[7]在工业生产中更稳定、更安全，对环境要求较低[8-9]，它在食品中的应用可能为食品制造商提供更多便利。

2021年5月，国际益生菌与益生元科学协会（International Scientific Association of Probioticsand Prebiotics,ISAPP）将后生元定义为“对宿主有益的无生命微生物和/或其成分的制剂”。已有研究证明后生元对机体的健康促进作用如治疗和预防酒精引起的肝病、结肠炎、调节免疫系统和肠道微生物群等[9]。同时，β-葡聚糖作为一种机体免疫增强剂，具有调控机体免疫力和调节动物胃肠道微生态平衡的功能，同时具有抗氧化[10]、抗炎[11]、降血糖[12]等多种健康促进能力。

2021年5月17-23日是第七届全民营养周。今年的宣传口号是“健康中国营养先行”，传播主题为“合理膳食营养惠万家”。确保优质蛋白的摄入是合理膳食以及增强免疫力的重要膳食原则，而奶制品的摄入是保证优质蛋白摄入的重要途经。同时，健康问题受到越来越多国人的重视，这使得健康相关的功能食品有了发展空间。本次研究的样品为含有后生元和β-葡聚糖的乳饮料，前期已有研究证明两者对免疫功能调节的积极作用。

本文从细胞免疫、体液免疫、巨噬细胞功能和NK细胞活性四个方面就含有后生元和β-葡聚糖的乳饮料对小鼠免疫功能的调节作研究，为推广含有后生元或/和β-葡聚糖的乳饮料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品与配制

内蒙古伊利实业集团股份有限公司提供含后生元和酵母β-葡聚糖的乳饮料冻干粉。样品中的后生元和酵母β-葡聚糖含量见表1。

表1 样品中的后生元和酵母β-葡聚糖含量（以240mL计）

称取一定量的冻干粉末，加一定量的蒸馏水将其分别配制成4.69 g/100 mL、11.73 g/100 mL及28.16 g/100 mL的溶液，现配现用。给样方式：经口灌胃，按照体重3 mL/100 g，每日一次。以人（60 kg）每日摄入一瓶240 mL的乳饮料计算，不确定系数为10，则小鼠（20 g）每日需摄入0.8 mL乳饮料。冻干样品干物质含量为3.52%，0.8 mL饮品浓缩后干物质量为：0.8×3.52%=0.02816 g，则低剂量干预组的灌胃溶液浓度为4.69 g/100 mL，中、高剂量分别为低剂量的2.5倍和6倍，因此灌胃溶液浓度为11.73 g/100 mL及28.16 g/100 mL。

1.1.2 实验动物及设计

BALB/c雄性小鼠，6～8周龄，18～22 g，SPF级，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司（生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001）。

将小鼠随机分为4个免疫组。免疫一组：进行体重、脏器系数，碳廓清实验；免疫二组：进行迟发型变态反应、血清溶血素测定、脾空斑形成实验；免疫三组：进行脾淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定；免疫四组：进行吞噬细胞活性测定。4个免疫组分别设置样低、中、高3个剂量组，同时设置空白对照组。干预组每日分别灌胃高、中、低剂量的（1408、3520、8448 mg/kg·bw）样品溶液，空白组灌胃蒸馏水。所有动物连续灌胃30 d。每周称量一次体重，并且根据体重调整灌胃量。

1.1.3 饲养管理

饲养于四川省疾病预防控制中心毒理所实验动物中心SPF级动物房。适应性喂养5 d后开始实验。SPF小鼠维持饲料（四川省人民医院实验动物研究所提供），动物饮水符合GB5749-2006的要求。实验室温为度20～26℃，日温差≤4℃，相对湿度40%～70%，换气次数10～20次/h，压强梯度≥10 Pa，12/12 h明暗交替照明。

1.1.4 主要仪器与试剂

紫外可见分光光度计,上海精科；生物显微镜,上海光学仪器厂；2010型酶标仪,德国ThermoFisher公司；离心机,德国Eppendorf公司；电子分析天平,德国赛多利斯公司；绵羊红细胞-SRBC、SA缓冲液、新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司；精致墨汁,北京一得阁墨业有限公司；PRMI1640培养基,美国Gibco公司。

1.2 实验方法

迟发型变态反应实验(足跖增厚法)、血清溶血素测定和抗体生成细胞检测(改良玻片法)，脾淋巴细胞转化实验(MTT法)，NK细胞活性测测定，鸡吞实验，碳廓清试验，以上实验方法均参照《保健食品检验与评价技术规范(2003)》[13]。

1.2.1 统计学分析

2 结果与讨论

2.1 乳饮料对小鼠体重及脏器指数的影响

实验期间，各组动物体重稳定增长。各剂量动物初始体重和实验末期体重与对照组相比较，无显著差异（P＞0.05）。其中干预组第7天时，低、中剂量组体重显著高于对照组（P＜0.05），第14天时，低、高剂量组体重显著高于对照组（P＜0.05），结果见表2。与对照组相比较，各剂量组动物的脾脏及胸腺指数均无显著差异（P＞0.05），结果见表3。

表2 不同浓度乳饮料对小鼠体重影响(,n=13)

表2 不同浓度乳饮料对小鼠体重影响(,n=13)

注：a表示与对照组比较，P＜0.05。下同。

样品名称 组别 第1天/g 第7天/g 第14天/g 第21天/g 第28天/g蒸馏水 对照组 20.1±0.9 20.6±1.1 21.5±1.2 22.4±1.3 23.4±1.4乳饮料 低剂量组 20.9±0.6 22.1±1.0a 22.7±1.3a 23.4±1.1 23.8±1.4中剂量组 20.1±0.4 21.8±0.9a 22.5±1.0 23.2±1.0 24.1±1.1高剂量组 20.3±0.9 21.6±1.3 22.9±1.5a 22.9±1.2 23.1±1.5

表3 不同浓度乳饮料对小鼠脾脏及胸腺指数影响(±s,n=13)

表3 不同浓度乳饮料对小鼠脾脏及胸腺指数影响(±s,n=13)

注：脏器体重比值=×100

样品名称 组别 终体重/g 脾脏 胸腺绝对重量/mg 脾脏体重比值 绝对重量/mg 胸腺体重比值蒸馏水 对照组 23.4±1.4 80.92±7.17 0.35±0.04 57.85±11.51 0.25±0.06乳饮料 低剂量组 23.8±1.4 78.38±9.79 0.33±0.04 59.62±11.82 0.25±0.06中剂量组 24.1±1.1 75.77±5.26 0.31±0.02 62.00±18.72 0.26±0.07高剂量组 23.1±1.5 74.46±6.36 0.33±0.04 45.77±16.27 0.20±0.08

2.2 乳饮料对小鼠细胞免疫功能的影响

与对照组相比较，各剂量组动物的淋巴细胞增值能力无显著变化（P＞0.05），中、高剂量组的24 h足跖增厚有增加趋势，其中高剂量组增加具有统计学意义（P＜0.05），结果见表4。

表4 不同浓度乳饮料对小鼠细胞免疫影响(±s,n=13)

表4 不同浓度乳饮料对小鼠细胞免疫影响(±s,n=13)

样品名称 组别 ConA诱导脾淋巴细胞增殖能力 24 h足跖增厚/mm蒸馏水 对照组 0.15±0.07 0.72±0.21乳饮料 低剂量组 0.17±0.08 0.72±0.20中剂量组 0.17±0.06 0.86±0.12高剂量组 0.19±0.09 0.95±0.19a

2.3 乳饮料对小鼠体液免疫功能的影响

与对照组相比较。干预组小鼠的脾空斑形成数均增多，其中低、高剂量组增多有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比较，干预组的抗体积数均未有显著性改变（P＞0.05），结果见表5。

表5 不同浓度乳饮料对小鼠体液免疫影响(±s,n=13)

表5 不同浓度乳饮料对小鼠体液免疫影响(±s,n=13)

样品名称 组别 脾空斑形成数（/106脾细胞） 抗体积数蒸馏水 对照组 210.00±16.07 152.31±24.47乳饮料 低剂量组 241.92±27.88a 151.62±29.35中剂量组 217.69±37.06 159.31±24.47高剂量组 269.62±59.88a 154.77±23.29

2.4 乳饮料对巨噬细胞功能的影响

与对照组相比较，干预组各剂量组的吞噬率和吞噬指数没有显著差异（P＞0.05），结果如表6所示。与对照组相比较，干预组各剂量组小鼠的终体重、肝脏重量、吞噬指数没有显著差异（P＞0.05），结果如表7所示。

表6 不同浓度乳饮料对小鼠巨噬细胞功能影响－鸡吞实验(±s,n=13)

表6 不同浓度乳饮料对小鼠巨噬细胞功能影响－鸡吞实验(±s,n=13)

样品名称 组别 吞噬率/% 吞噬指数蒸馏水 对照组 21.31±2.05 0.83±0.02乳饮料 低剂量组 23.15±1.99 0.84±0.03中剂量组 23.19±3.65 0.84±0.04高剂量组 22.88±1.98 0.82±0.03

表7 不同浓度乳饮料对小鼠巨噬细胞功能影响－碳廓清实验(±s,n=13)

表7 不同浓度乳饮料对小鼠巨噬细胞功能影响－碳廓清实验(±s,n=13)

名称 组别 体重/g 肝脏重量/mg 脾脏重量/mg 吞噬指数样品蒸馏水 对照组23.4±1.4 80.92±7.17 4.92±0.98乳饮料 低剂量组23.8±1.4 78.38±9.79 4.91±0.54中剂量组24.1±1.1 75.77±5.26 4.48±0.51高剂量组23.1±1.5 1051.54±100.68 1044.23±101.06 1058.23±93.25 1000.31±148.73 74.46±6.36 5.15±1.01

2.5 乳饮料对NK细胞活性的影响

与对照组相比较，干预组的中、高剂量组NK细胞活性率有显著增高（P＜0.05）。结果见表8。

表8 不同浓度乳饮料对NK细胞活性的影响(±s,n=13)

表8 不同浓度乳饮料对NK细胞活性的影响(±s,n=13)

样品名称 组别 NK细胞活性率/% 转换值蒸馏水 对照组 16.52±10.50 0.41±0.13乳饮料 低剂量组 14.49±7.37 0.38±0.11中剂量组 26.87±9.28a 0.54±0.10a高剂量组 26.47±11.28a 0.53±0.14a

3 结论

研究表明，乳饮料的低、高剂量组的脾空斑形成数均明显增加，反映了样品在体液免疫上有一定作用。样品的中、高剂量组NK细胞活性显著增高，反映样品对非特异性免疫的改善有一定作用。

后生元中的非活性微生物细胞较益生菌可能表现出更强的安全性，即降低败血症和抗生素耐药性的风险，以及技术和实践益处，即更长的保质期，因为微生物已经失去活力，具有稳定性，因此可以不需要冷链运输。这些特征也使其能够在发展中地区应用。更为重要的是，已证明后生元可调节动物和人类的抗炎和阳性免疫应答。后生元能够通过增加免疫球蛋白、激活巨噬细胞等途径来增强特异性和非特异性的免疫应答[13]。

几项研究调查了后生元对免疫系统反应的影响。例如，Chuang等人检测了3种热灭活乳杆菌菌株对小鼠脾细胞增殖和小鼠树突状细胞活化的影响，证明了其调节白细胞介素分泌的有效性[17]。Lopez等人证明在人上皮性结直肠腺癌Caco-2细胞系中，紫外线灭活的鼠李糖乳杆菌GG细胞在鞭毛蛋白诱导下可减少IL-8的产生[18]。据报道，鼠李糖乳杆菌ATCC7469的热灭活细胞均能够诱导小鼠巨噬细胞合成具有促炎（TNF-α和IL-6）或调节(IL-10)功能的不同细胞因子[19]。最近有研究评估了热灭活短乳杆菌KCCM12203P细胞与其活对应物相比的抗氧化活性和免疫刺激潜力[20]，发现热灭活短乳杆菌KCCM12203P细胞有更高的抗氧化活性且拥有免疫刺激潜力。

免疫力下降是众所周知的老龄化后果，可能导致老年人易患呼吸道感染[21]。在一项对老年受试者的随机安慰剂对照双盲试验中，Kotanietal.证实经口摄入戊糖乳杆菌b240的热灭活细胞可诱导唾液免疫球蛋白A(sIgA)分泌增加，sIgA在介导体液粘膜免疫应答中发挥关键作用[22]。而且，口服摄入戊糖乳杆菌b240对老年人普通感冒发挥保护作用（降低其发病率）与这种后生元通过增强sIgA的分泌改善黏膜免疫的能力有关。接受补充膳食的老年组的总体幸福感也有所增加，这与普通感冒无关，因此表明食用后生元会产生其他有益作用[23]。Murata等人最近观察到，摄入热灭活副干酪乳杆菌MCC1849细胞在内的饮食在易患普通感冒的年轻健康成人受试者亚组进行研究引起了相似的效应（即使在精神压力条件下也可改善对普通感冒感染的抵抗力和维持理想的情绪）[24]。也已在健康成人（包括有限的老年受试者亚组）中证明了热灭活植物乳杆菌L-137细胞促进的免疫功能增强与健康相关生活质量(QOL)改善之间的严格关系[25]。

β-葡聚糖作为一种可溶性膳食纤维，具有多种健康促进能力。本研究中的酵母β-葡聚糖的体外益生元效应研究结果表明，其在一定程度上能够抵抗胃酸和人体消化酶的水解，利于有益菌群提前进入对数生长期，且能够促进益生菌增殖，是一种具有潜在应用价值的益生元[26]。酵母β-葡聚糖已被多项临床研究证明其能提高免疫力健康[14-16]。

后生元和β-葡聚糖的协同作用在生物体内已有体现。Mahmoud[27]等人研究了热灭活植物乳杆菌和β-葡聚糖对鱼类的生长性能、饲料利用、健康状况的影响，发现在试验条件下，日粮中添加热灭活植物乳杆菌和β-葡聚糖对提高红鲷的生长、消化率和免疫应答具有显著的协同作用。

本次研究样品为含有后生元和β-葡聚糖的乳饮料，虽然有研究曾将酵母β-葡聚糖作为增稠剂加入到脱脂酸奶中，结果显示，酸奶的总体喜好评分有显著增加[29]。但研究牛奶中强化β-葡聚糖对免疫功能的影响的文章鲜少，在一项双盲，随机，对照，前瞻性试验中，食用包含二十二碳六烯酸，益生元和低聚半乳糖以及酵母β-葡聚糖的配方奶粉儿童的白细胞介素10和白细胞增加，表明抗炎机制和免疫细胞效应子增加[30]。综上，在牛奶中同时添加益生菌和β-葡聚糖与免疫功能的改善有一定关系，与本次研究的结果一致。因此可见，研究添加了后生元和β-葡聚糖的牛奶有一定现实意义。

以上研究结果显示，在本实验条件下，给BALB/c小鼠灌胃含有后生元和酵母β-葡聚糖的乳饮料样品后，其体液免疫功能和NK细胞活性改善效果明显，提示该受试样品可能具有增强免疫力的潜在功效。