柴葶宁肺颗粒质量标准研究*

杨仁耐，吴红燕，李慧媛，王举涛，2，刘劲松△

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012； 2.中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012）

柴葶宁肺颗粒由柴胡、葶苈子、黄芩、白芍、钩藤、全瓜蒌、姜半夏、地龙、乌梅、丹参、甘草等15 味中药材组方，具有调肝理肺、止咳平喘等功效，主治支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病。原方剂为汤剂，存在服用量大、携带不方便等缺点，现按传统工艺，经水提取后研制成方便服用、易携带的口服颗粒剂，既遵循传统中药复方的经验，又尽可能保留处方中药材的有效成分，确保疗效。本研究中采用薄层色谱（TLC）法定性鉴别制剂中的丹参、白芍、黄芩、钩藤，采用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中芍药苷、黄芩苷、丹酚酸B、甘草酸、汉黄芩素的含量，以为柴葶宁肺颗粒质量标准的建立提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ULtiMate 3000 型色谱系统（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）；AUW220D 型十万分之一电子天平（日本Shimadzu 公司）；FA2004B 型万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；JK - 250DB 型超声仪（合肥金尼克机械制造有限公司）。

1.2 试药

柴葶宁肺颗粒（淮北市中医医院制剂室，批号分别为20201001，20201002，20201003）；丹酚酸B 对照品（批号为DST190918-009，含量≥98%），芍药苷对照品（批号为MUST - 16041901，含量≥99%），黄芩素对照品（批号为DST191012-024，含量≥98%），汉黄芩素对照品（批号为DST191023-025，含量≥98%），均购自成都德斯特生物技术有限公司；黄芩苷对照品（批号为110715-201318，含量≥93%），甘草酸铵对照品（批号为110731-201619，含量≥93%），丹参对照药材（批号为120923 - 201816），白芍对照药材（批号为120905 -201610），黄芩对照药材（批号为120955 - 201810），钩藤对照药材（批号为121190 - 201204），均购自中国食品药品检定研究院；聚胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；硅胶G 薄层板、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

丹参［1-2］：取丹酚酸B 对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL 的对照品溶液。取丹参对照药材1 g，加50 mL 水，煮20 min，滤过，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，即得丹参对照药材溶液。取样品内容物10 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声（功率为200 W，频率为50 kHz，下同）处理30 min，滤过，滤液蒸干后加水10 mL 使溶解，用乙醚萃取2次（每次10 mL），合并有机相，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，即得供试品溶液。按柴葶宁肺颗粒处方和工艺制备缺丹参的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述4 种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯- 三氯甲烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 甲酸（2∶3∶4∶2∶0.5，V/V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液和对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

1-3.供试品溶液 4.对照药材溶液 5.对照品溶液6.阴性对照品溶液A.丹参 B.白芍图1 丹参和白芍的薄层色谱图1 - 3.Test solution 4.Reference material solution 5.Reference solution 6.Negative reference solutionA.Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizome B.Paeoniae Radix AlbaFig.1 TLC chromatograms of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizome and Paeoniae Radix Alba

白芍［2-3］：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL 的对照品溶液。取白芍对照药材1 g，加50 mL 水，煮20 min，滤过，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，即得白芍对照药材溶液。取样品内容10 g，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干后加甲醇1 mL 使溶解，即得供试品溶液。按柴葶宁肺颗粒处方和工艺制备缺白芍的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述4 种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液和对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

黄芩［4］：取黄芩素和汉黄芩素对照品各适量，精密称定，加甲醇分别制成质量浓度为0.5 mg/mL 的单一对照品溶液。取黄芩对照药材1 g，加50 mL水，煮20 min，滤过，水浴蒸干，加甲醇1 mL 使溶解，即得黄芩对照药材溶液。取样品内容物10 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干后加水10 mL使溶解，加稀盐酸调pH 至1～2，滤过，滤液用乙酸乙酯10 mL振摇提取，分取有机相，水浴蒸干，加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液。按柴葶宁肺颗粒处方和工艺制备缺黄芩的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述5 种溶液各5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯- 乙酸乙酯- 甲醇- 甲酸（10∶3∶2.5∶0.1，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷三氯化铝试液检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液和对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图2 A。

钩藤［5］：取钩藤碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL 的对照品溶液。另取钩藤对照药材1 g，加50 mL 水，煮20 min，滤过，水浴蒸干，加甲醇1 mL使溶解，即得钩藤对照药材溶液。取样品内容物10 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干后加5%氢氧化钠溶液10 mL 使溶解，用三氯甲烷萃取2 次（每次10 mL），合并有机相，水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解，即得供试品溶液。按柴葶宁肺颗粒处方和工艺制备缺钩藤的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。吸取上述4 种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮-氨水（3∶3∶2∶0.1，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液和对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图2 B。

1.黄芩素对照品溶液 2.汉黄芩素对照品溶液 3.钩藤碱对照品溶液 4.对照药材溶液 5-7.供试品溶液 8.阴性对照品溶液A.黄芩 B.钩藤图2 黄芩和钩藤的薄层色谱图1.Reference solution of baicalein 2.Reference solution of wogonin 3.Reference solution of rhynchophylline 4.Reference material solution 5-7.Test solution 8.Negative reference solutionA.Scutellariae Radix B.Uncariae Ramulus cum UncisFig.2 TLC chromatograms of Scutellariae Radix and Uncariae Ramulus cum Uncis

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Tabitha RZ - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min 时10%A→15%A，10～20 min 时15%A→20%A，20～50 min 时20%A→29%A，50～60 min 时29%A→50%A，60 ～70 min 时50%A→15%A）；流速：1 mL / min；检测波长：245 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.芍药苷 2.黄芩苷 3.丹酚酸B 4.甘草酸 5.汉黄芩素A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C.缺甘草的阴性对照品溶液 D.缺白芍的阴性对照品溶液 E.缺丹参的阴性对照品溶液F.缺黄芩的阴性对照品溶液图3 高效液相色谱图1.Paeoniflorin 2.Baicalin 3.Salvianolic acid B 4.Glycyrrhizic acid 5.WogoninA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Glycyrrhizae Radix et Rhizoma D.Negative reference solution lacking Paeoniae Radix Alba E.Negative reference solution lacking Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizome F.Negative reference solution lacking Scutellariae RadixFig.3 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制备

取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芍药苷130.14 μg、黄芩苷148.53 μg、丹酚酸B 94.86 μg、甘草酸12.76 μg、汉黄芩素12.54 μg 的混合对照品溶液。取样品内容物1.0 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，超声处理30 min，放冷，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按柴葶宁肺颗粒处方和工艺分别制备缺白芍、缺黄芩、缺丹参、缺甘草的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成相应阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2.2.2 项下3 种溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照品溶液与混合对照品溶液色谱中相同保留时间处均无干扰峰，表明方法专属性良好。详见图3。

线性关系考察：分别精密量取2.2.2项下混合对照品溶液1，2，4，6，8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。取10 μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围（n=5）Tab.1 Regression equations and linear ranges（n=5）

精密度试验：取2.2.2 项下供试品溶液适量，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果芍药苷、黄芩苷、丹酚酸B、甘草酸、汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.01%，0.85%，1.05%，1.18%，1.26%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取2.2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，4，8，12，16 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芍药苷、黄芩苷、丹酚酸B、甘草酸、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.84%，1.02%，0.87%，1.23%，0.75%（n=5），表明供试品溶液在室温放置16 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品（批号为20201001）适量，各6 份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果芍药苷、黄芩苷、丹酚酸B、甘草酸、汉黄芩素 的 平 均 含 量 分 别 为3.047 8，5.705 1，1.103 8，0.121 2，0.078 8 mg/ g，RSD分别为0.87%，1.64%，1.17%，0.43%，1.66%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20201001）适量，共9份，分别加入一定质量浓度的对照品溶液，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Result of the recovery test（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取3 批样品各适量，分别按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，并计算样品含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of five components in the samples（mg/g，n=3）

3 讨论

柴葶宁肺颗粒组方中，柴胡主归肝、胆经，性寒，主升散；葶苈子主归肺、膀胱经，大寒之品，主降，临床用于痰多阻肺、咳嗽、呃逆等证，二者共为君药。黄芩、全瓜蒌、姜半夏三药均可调节胸闷、疏理气机、除热化痰，对咳嗽等呼吸道疾病有良好疗效［6］；钩藤味甘，性寒，归肝经，能清热、平熄肝风；地龙味咸，性寒，入肝、肺二经，平肝活络，清肺平喘；白芍养血敛阴、柔肝止痛；乌梅平肝敛肺化阴、生津，同时乌梅白芍相伍可有效抑制柴胡升发太过，耗气伤阴［7］，七药合用，共助君药调理肝肺，为臣药。甘草味甘，性平，有调和诸药功效，为使药［8-9］。

参考2020年版《中国药典（一部）》及相关文献，对组方中各药味进行TLC 摸索，发现柴胡、葶苈子、全瓜蒌、姜半夏、地龙、乌梅的TLC 色谱均存在阴性干扰［10-12］，或供试品中未见相同斑点的情况，故暂未列入质量标准，有待进一步研究。方中丹参TLC 鉴别时，由于制剂处方制备工艺为水煎煮，丹参酮ⅡB为脂溶性成分，故选择丹酚酸B作为鉴别指标。供试品制备采用乙醇超声处理时，杂质点多，分离效果不佳。采用甲醇超声后用乙醚萃取，结果斑点清晰，无干扰。黄芩TLC 鉴别时，先采用操作简单的GF254板，紫外下检视，结果显示供试品斑点较多、分离度及点的成型性均较差。优化后采用聚酰胺薄膜，同一展开系统下展开，三氯化铝显色后，斑点清晰、分离度好。钩藤TLC 鉴别时，首先按药典方法采用石油醚- 丙酮为展开系统，但展开及分离度均欠佳，后将展开系统换成甲苯-三氯甲烷-丙酮-氨水，结果斑点清晰，分离度好。

药理学研究表明，黄芩苷、汉黄芩素可有效缓解机体咳喘，延长咳喘潜伏期，可治疗咳喘［12-13］。甘草酸在预防和治疗肺纤维化及支气管炎等方面效果显著［14］。白芍具有抗炎、调节免疫、保肝等药理活性。芍药苷是白芍中主要的活性物质［15］，可显著抑制模型小鼠肺部炎症、哮喘模型小鼠气道炎症［16］，芍药甘草汤具有平喘和抗过敏作用［17］。丹参在治疗小儿重症肺炎、慢性阻塞性肺疾病有显著疗效［18-19］。故选择上述5 种成分作为多指标含量测定指标。

预试验中分别以乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈- 0.2%磷酸水溶液、甲醇- 水（梯度洗脱）作为流动相，结果采用乙腈- 0.1%磷酸水溶液时，色谱峰分离效果好，峰形最佳。选择供试品溶液提取溶剂时，将50%甲醇、70%甲醇、甲醇作对比，结果甲醇提取效率最高。预试验结果表明，同一波长下70 min 内5 种有效成分的分离效果和峰形均良好［20-21］。

综上所述，本研究中建立的方法可用于柴葶宁肺颗粒的质量控制。