木姜叶柯不同表型叶中二氢查耳酮类物质的差异分析*

王 颂 黄俊彬 徐巧林 陈颖乐黄文妍 王志宏 余玉娟 曾 雷

（广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520）

木姜叶柯Lithocarpus litseifolius属于壳斗科柯属植物，是山地常绿的常见树种[1]。作为一种天然茶饮，木姜叶柯的利用历史可追溯到南朝时期，在《本草纲目》和《茶经》等均有记载[2]。其嫩叶嚼烂时为粘胶质，因具明显甜味，民间常以其叶冲泡成茶汤，常被称为“甜茶”[3-4]。以甜茶叶入药，具有清热利尿、滋润肝肾、润肺镇咳等功效，可预防温热痢疾、皮肤瘙痒和痈疽恶疮等症状[5-7]；现代研究也证明，木姜叶柯含有黄酮类、多酚类、多糖类、三萜类、甾体类、氨基酸和微量元素等成分[8-13]，具有“一健一润一醒”和“三防三抗四降”等作用功效[2,5,12,14]，被誉为兼具茶、糖、药于一体的“树上虫草”[4]，并于2017 年6月被批准为新食品原料[15]。

经研究发现，木姜叶柯中黄酮类物质主要为二氢查耳酮，包括根皮苷、三叶苷和根皮素等[11,16-17]。其中根皮苷和三叶苷互为同分异构体[2]，根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，为微黄色或白色针状结晶物质，味先甜后苦[17]，具有降血糖、抗氧化、改善记忆力和抗癌等生物活性[18-19]；根皮素则具有抗氧化、抗炎、免疫抑制、抗癌和抗肿瘤作用，可清除皮肤内自由基，抑制黑色素细胞活性，同时可以抑制血管内皮功能失调以及肝损伤的发生[17,20-21]；三叶苷能够抑制炎症因子的分泌，抗氧化能力显著，并且对于糖尿病的防治具有潜在的应用价值[22-24]。基于良好的开发利用前景，目前对于木姜叶柯的资源繁育、种植、特征成分的提取制备等方面已经开展了一些研究[25-30]，王钰等[31]建立了同时测定木姜叶柯中根皮苷、三叶苷和根皮素等高效液相色谱方法，可为其质量控制提供有效的检测技术。但是关于木姜叶柯不同表型叶中二氢查耳酮类物质含量的动态变化却鲜有报道。

本研究主要通过对同时检测木姜叶柯根皮苷、三叶苷和根皮素的高效液相色谱法进行优化，并分析木姜叶柯不同表型叶片中根皮苷、三叶苷和根皮素在不同月份的含量差异，从而为木姜叶柯的品质评价和良种选育及采收提供有价值的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试药

木姜叶柯样品材料采集于湖南富农甜茶有限责任公司长田溪基地，经中国科学院昆明植物研究所杨永平研究员鉴定为木姜叶柯，不同表型叶包括大叶型、尖叶型和紫叶型，各样品分别于7月、8 月、9 月和10 月中旬进行采摘。7 月、8月、9 月和10 月每月各采集30 批次样品，包括10 批次大叶型、10 批次尖叶型、10 批次紫叶型，共计120 批次样品。经50℃烘干，粉碎后过65 目标准筛，得样品粉末，4℃保存待用。不同品种木姜叶柯见图1。

无水乙醇、乙腈（色谱级，fisher chemical），甲酸（色谱级，上海麦克林生化科技有限公司），根皮苷对照品（纯度98%，上海诗丹德标准技术服务有限公司），三叶苷对照品（纯度98%，上海诗丹德标准技术服务有限公司），根皮素对照品（纯度98%；上海诗丹德标准技术服务有限公司），实验用水为超纯水，纯度符合GB/T 6682-2008 一级水要求。

1.2 仪器

电热鼓风干燥箱（HK-92401X，广州市深华生物技术有限公司）；流水式中药粉碎机（HK-08B，广州市旭朗机械设备有限公司）；标准筛（65目，绍兴上虞圣超仪器设备有限公司）；电子分析天平（BM-500，日本艾安得）；超声波清洗机（SB-5200DT，宁波新芝生物科技有限公司）；实验室超纯水系统（WP-RO10B，四川沃特尔水处理设备）；真空抽滤装置（T-50.2L 型，天津市津腾实验设备）；高效液相色谱仪（LC-20A，岛津有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱分析条件：色谱柱InertSustain C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.04%甲酸水溶液（B）梯度洗脱（表1）；流速0.8 mL·min-1；柱温40℃；进样量5.0 μL。检测波长：根皮苷、三叶苷和根皮素均为285 nm。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

1.3.2 对照品溶液的制备 分别准确称取5.0 mg三叶苷、根皮苷、根皮素的标准品置于10 mL容量瓶，加入70%乙醇，待充分溶解并定容到10 mL。

1.3.3 供试样品溶液制备与分析 精密称取木姜叶柯样品粉末0.25 g 3 份，分别置于3 个25 mL 具塞锥形瓶中，各加入10 mL 70%乙醇，连同锥形瓶称定总质量记为m1，超声（功率100 W，频率40 kHz）提取30 min，放置至室温后用70%乙醇补足质量达到m1，摇匀，离心，取上清液1.0 mL置于10 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度线，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，滤液作为木姜叶柯样品供试溶液。按照步骤1.3.1 条件进行分析。

1.4 数据分析

利用Excel2010 软件进行数据的整理和基础统计，运用SPSS 23.0 软件对不同叶型木姜叶柯的三种化学成分进行方差分析、相关分析、多重比较和聚类分析[32]。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 标准曲线绘制 精密吸取标准品母液，按照1、2.5、5、10、20、40、50 倍数进行稀释，得系列质量浓度溶液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取各个浓度的标准品溶液各5 μL 注入高效液相色谱仪，按1.3.1 色谱条件测定峰面积。以进样浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，分别得各标准品回归方程及线性范围。并根据3 倍信噪比与10 倍信噪比法计算检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果如表2 所示，标准品高效液相色谱图见图2。

图2 标准对照品和木姜叶柯样品的高效液相色谱图Fig. 2 HPLC of standard reference substance and samples

表2 拟合方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限Table 2 Fitting equation, correlation coefficient, linear range, and detection limit, detection limit

2.1.2 重复性试验 取同一木姜叶柯供试样品粉末6 份，每份0.25 g，根据制备方法制备木姜叶柯供试品溶液，根据色谱条件进行测定，记录测定浓度。通过对同一样品进行平行6 次测定，计算其相对标准偏差RSD，对方法重复性进行验证。结果显示根皮苷、三叶苷和根皮素浓度的RSD 值分别为0.47、0.17 和1.35（表3），表明方法重复性好。

表3 重复性试验结果Table 3 The result of repeatability

2.1.3 精密度试验 吸取同一混合对照品溶液，按色谱条件连续测定6 次，记录测定浓度，结果见表4。结果显示根皮苷、三叶苷和根皮素含量的RSD 值分别为0.37、0.12 和0.83，表明仪器精密度良好。

表4 精密度试验结果Table 4 The result of precision

2.1.4 日内稳定性试验 取同一供试样品溶液，根据色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10 和12 h 进行测定，记录测定浓度。结果显示不同时间测定的根皮苷、三叶苷和根皮素含量的RSD 值分别为0.52、0.73 和1.21（表5），表明供试样品溶液在12 h 内稳定。

表5 日内稳定性试验结果Table 5 The result of intraday stability

2.1.5 加标回收率试验 取已知根皮苷、三叶苷和根皮素含量的木姜叶柯样品粉末各9 份，每份0.25 g，分别按照低、中和高比例添加适量根皮苷、三叶苷和根皮素的标准溶液，按照液相色谱检测方法测定含量。通过加标回收率试验，计算回收率，结果见表6。不同二氢查耳酮的平均回收率在80%～110%之间，而且RSD 均小于2.0。

表6 加标回收率试验结果Table 6 The result of standard recovery rate

2.2 木姜叶柯二氢查耳酮类物质含量差异分析

基于采集所得的木姜叶柯样品，按照不同月份和不同表型叶，对其特征二氢查耳酮类物质进行差异分析（图3）。

图3 木姜叶柯不同采集月份和不同表型叶三种二氢查耳酮类物质的差异性分析Fig. 3 The diversity analysis of three dihydrochalcones from L. litseifolius of different collection months and different phenotypes leaves

不同月份采集的木姜叶柯叶片样品的根皮素含量、根皮苷含量、三叶苷含量均存在极显著性差异（P＜0.001）。对于根皮苷而言，7—10 月，随着月份的增加，叶片根皮苷含量逐渐增加，10月份木姜叶柯的根皮苷含量最高；对根皮素而言，7 月份叶片的根皮素含量最高，8 月和9 月含量有所下降，10 月根皮素含量升高，显著低于7 月份时根皮素含量。三叶苷在不同月份间的变化规律与根皮素基本一致。

不同叶型的木姜叶柯，叶片的根皮素含量存在显著性差异（P＜0.05），根皮苷和三叶苷存在极显著性差异（P＜0.001）。大叶型木姜叶柯叶片的根皮素含量最高，根皮苷含量最低；尖叶型木姜叶柯的根皮苷含量最高，三叶苷含量和根皮素含量最低；紫叶型木姜叶柯的三叶苷含量最高，根皮素和根皮苷含量居中。

月份与叶型的交互作用对木姜叶柯的根皮苷含量具有显著性影响（P＜0.05），对根皮素和三叶苷含量具有极显著性影响（P＜0.001）。7 月份采集的大叶型木姜叶柯叶片样品的根皮素含量最高，9 月份采集的尖叶型的根皮素含量最低；10 月份采集的尖叶型木姜叶柯的根皮苷含量最高，7 月份的大叶型木姜叶柯的根皮苷含量最低；7 月份采集的紫叶型木姜叶柯的三叶苷含量最高，9 月份的尖叶型木姜叶柯的三叶苷含量最低。

3 结论与展望

本研究通过高效液相色谱法对木姜叶柯3 种表型叶在7、8、9 和10 月二氢查耳酮类成分（根皮素、根皮苷和三叶苷）进行对比分析，结果发现：不同采收时间的大叶型、尖叶型和紫叶型木姜叶柯中根皮苷、三叶苷、根皮素等化学成分存在显著性差异，其中采收时间和叶型均为影响有效成分含量的主效应。在不同的采集月份，根皮素和三叶苷变化趋势相近，均在8 或9 月份含量较低，根皮苷则在7—10 月份采收期间，具有逐步升高的趋势。大叶型木姜叶柯中根皮素在7 月份含量最高；7 月份采收时，紫叶型三叶苷含量要明显高于大叶型和尖叶型；从整体分析，根皮苷在10 月份采收时，含量要高于7、8 和9 月份，且其在3 种叶型根皮苷的含量也较为接近。

通过对不同采收时间的3 种叶型木姜叶柯有效特征成分含量分析，可以为木姜叶柯的优良种选育和高值化利用提供理论依据，但由于试验条件受限，本实验中仅对7—10 月份的不同样品进行采集与分析，所以对于全年以及不同生长环境的木姜叶柯特征二氢查耳酮类物质的动态累积与含量分布仍需在后续研究中不断完善。