桉树抗桉树枝瘿姬小蜂效果评价分析*

张华峰

（1.厦门市绿化中心，福建 厦门 361004；2.福建农林大学 林学院，福建 福州 350002）

桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa属膜翅目Hymenoptera 姬小蜂科Eulophidea 昆虫，是一种危害桉属植物的外来入侵害虫[1]。该蜂最早在中东和地中海地区发现并造成危害，随后入侵到印度、中国和巴西等桉树种植大国，目前该蜂已在大洋洲、亚洲和欧洲等5 大洲45 个国家和地区分布定殖。桉树Eucalyptusspp.是世界三大速生树种之一，具有适应性强、轮伐期短、繁殖容易等特点，已在5 大洲120 个国家和地区种植，种植总面积超过2 500 万hm2。我国自19 世纪末开始引种桉树[2]，在华南及西南地区大面积推广种植，面积达512 万hm2，排名全球第三[3]。2007 年在我国广西东兴首次发现桉树枝瘿姬小蜂，由于其具有传播途径多，扩散能力强，防治难度大等特点[4]，目前已传播扩散至广西、海南和福建等8 省区[5-7]，对我国桉树人工林造成严重危害，给桉树产业发展造成巨大损失[4-5]。张华峰等[7-8]、魏初奖等人[9]采用筛选桉树抗虫品种（无性系），淘汰易感品种（无性系）等方法，有效控制了福建大部分桉树栽种区桉树枝瘿姬小蜂的发生危害。但目前在园林绿化行道树，或小部分桉树种植的北缘地区仍种植抗寒性较强但易感虫桉树品种（无性系），仍需探索更高效的防控措施。研究植物自身的防御能力和机制，探索增强植物防御能力的技术手段，是当今植物抗虫性研究的前沿和热点[10]。有研究表明，植物在植食性昆虫取食后能够在被害部位或植株系统内，通过植物诱导防御途径，降低营养物质的分配，增加次生代谢产物的含量，迅速增强防御酶活性等一系列化学防御反应，降低其对昆虫的适应性，诱导植物产生抗性，以抵御昆虫进一步取食[11-15]。植物诱导抗性一旦被激发，可在一定范围和时间内有效地抵御植食性昆虫的侵害，并具有较为广谱的抗虫作用[16-17]。目前有关诱导桉树产生抗虫性的研究报道较少。本研究通过桉树枝瘿姬小蜂产卵危害、针刺损伤和外源茉莉酸甲酯（MeJA）喷施等不同的诱导处理后，测定桉叶中与化学防御相关生理生化物质的变化，并用模糊相似优先比法分析比较不同的诱导处理对桉树枝瘿姬小蜂生长发育和种群动态的影响，综合评价桉树诱导抗性的抗虫效果，为防控桉树枝瘿姬小蜂提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料来源

供试苗木为巨桉Europhylla grandis无性系组培苗，苗高50 cm。在福建省漳州市微绿园林绿化工程公司苗圃的巨桉林内，于2021 年8 月中旬桉树枝瘿姬小蜂羽化期采集初羽化的雌成蜂供试。供试MeJA（纯度≥95%）采购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，试验时将MeJA 溶于乙醇中，加蒸馏水分别配制成不同浓度的溶液备用。

1.2 诱导处理

1.2.1 产卵诱导（Y1） 选15 株供试苗木，在每株苗木的东、西、南、北4 个方向各选取3 条嫩枝，用自制尼龙网袋套上，每枝分别接入20 头当天羽化出瘿的处女雌蜂，在雌蜂产卵危害1 d 后作为虫害诱导处理组供试。

1.2.2 针刺损伤诱导（Y2） 选15 株供试苗木，按照1.2.1 方法选取枝条，用钢针在枝的每片嫩叶叶柄、主脉基部及嫩枝上针刺20 个伤口，人工模拟昆虫产卵损伤，处理1 d 后作为针刺损伤诱导处理组供试。

1.2.3 MeJA 诱导 选60 株供试苗木，在苗木上用小型喷雾器分别均匀地喷洒0.05 mmol·L-1（Y3）、0.1 mmol·L-1（Y4）、0.5 mmol·L-1（Y5）和1.0 mmol·L-1（Y6）4 种浓度的MeJA 溶液，每种浓度各15 株苗木，将处理过的苗木分别放置于养虫笼（透明塑料薄膜密封）内，处理1 d 后作为MeJA 诱导处理组供试。

1.3 接虫方法

诱导处理后，在供试苗木的东、南、西、北4个方向各选取3 条健康枝条，套上网袋，每枝分别接入20 头当天羽化出瘿的处女雌蜂。

1.4 样品采集和测定

诱导处理1 d 后从试验处理苗木的东、南、西、北4 个方向各随机剪取10 片未损伤的嫩叶，组成混合样品装入保鲜袋内，迅速带回实验室冷冻保存备用。

测定叶片营养物质和次生物质含量试验时，先用蒸馏水冲洗叶片并晾干，再用牛皮纸包好放烘干箱，在60°C 恒温条件下持续烘干48 h 后，用粉碎机粉碎，过40 目筛，装入自封袋，放入干燥器中保存备测。分别用亚硝酸钠-硝酸铝比色法、钨酸钠-磷钼酸比色法、Folin-酚法、蒽酮比色法和凯氏定氮法，测定各处理样品中黄酮、单宁、总酚、可溶性糖（多糖）和蛋白质含量[9-10]，每份样品重复测定3 次。

测定叶片植物相关酶活性试验时，按上述的取样方式剪取桉树嫩叶，测定桉叶中保护性酶苯丙氨酸解氨酶PAL、超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD 和多酚氧化酶PPO 等4 种保护酶活性[11-12]，以及胰蛋白酶抑制剂TI 和胰凝乳蛋白酶抑制剂CI 等2 种植物蛋白酶抑制剂活性[13-14]，每份样品重复测定3 次。以上测定都以健康苗木作为对照组（CK）。诱导处理和对照各设3 次重复。

1.5 生物学观察

1.5.1 产卵刻痕 接虫处理后10 d，打开网袋，对每样枝各选择5 片叶进行观察，统计叶柄上产卵刻痕数。

1.5.2 生物测定 在桉树枝瘿姬小蜂羽化高峰期，从不同处理的植株上，随机剪取带有虫瘿的样枝，分别置于不同的养虫盒内，放入人工气候箱（设定温度30℃，湿度80% RH，光暗条件L ∶D=18 h ∶6 h）内收蜂，每天定时收集统计由虫瘿中羽化出孔的桉树枝瘿姬小蜂成虫。采集100 只雌成虫，迅速放入三星（RSG5SFPN）冰箱，在-20 ℃条件下速冻10 min。随后随机取30 只雌成虫，放入生理盐水（0.9%NaCl 无菌水溶液）内，在体视镜下解剖观察，并记录每只小蜂的怀卵量。用昆虫采集管收集当天羽化出蜂的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫，每管30 只，放在室温下（24～28℃），每天观察2 次，记录桉树枝瘿姬小蜂雌成虫的存活数，直至全部死亡，统计雌成虫寿命。

1.5.3 出蜂数量 桉树枝瘿姬小蜂羽化出孔后，选取30 个虫瘿，统计每个虫瘿上圆形的羽化孔做为出蜂数量。

1.6 种群趋势指数计算及数据分析

为了更好地比较评价不同诱导处理对桉树枝瘿姬小蜂生长发育及种群增长效应，分别统计桉树枝瘿姬小蜂存活率、雌性比和怀卵数，并用种群趋势指数（index of population trend，I）[18]计算，I=SE s PfP♀。式中，S为存活率,每个虫瘿出蜂数/虫瘿上的产卵刻痕数；ES为指定标准卵量，以从对照植株羽化出的雌成虫所怀卵数量为标准；Pf为达到标准卵量的比例；P♀为桉树枝瘿姬小蜂雌虫比例。

数据统计分析在SPSS17.0 和DPS v7.05 版统计软件进行模糊相似优先比分析[19]。本实验用经不同诱导处理后的桉叶中营养和次生代谢物质含量、保护酶活性和蛋白酶抑制剂活性等，与桉树化学防御相关生理生化物质和桉树枝瘿姬小蜂生长发育指标等指标做为待测数据。对待测数据ix通过标准化yi= ()/s,其中，x为平均值，进行无量纲处理后，进行模糊相似优先比分析，综合评价桉树诱导抗性的抗虫效果。

2 结果与分析

2.1 桉叶营养物质和次生代谢物质含量测定结果

经不同诱导处理后桉树叶主要营养物质和次生物质含量测定结果见表1。结果表明：经诱导处理1 d 后，不同处理间的桉叶中可溶性糖含量、多糖含量差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比含量均有显著下降；不同处理间的桉叶中蛋白质含量差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，除Y1处理含量变化不大外，其余处理均有显著下降；不同处理间的桉叶中黄酮含量差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，除Y2处理含量略有下降外，其余处理均有显著上升；不同处理间的桉叶中单宁含量差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，除Y6处理含量略有上升外，其余处理变化不大；不同处理间的桉叶中总酚含量差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，Y1、Y3和Y6处理含量有显著上升，其余处理变化不大。总体而言，诱导处理后桉叶相关营养物质含量处理组与对照相比含量有显著的下降，而次生物质中黄酮类等物质较对照相比含量有一定的上升。

表1 桉叶营养物质和次生代谢物质含量测定及方差分析结果 mg·g-1 Table 1 Results of variance analysis and contents of nutrients and secondary metabolites in Eucalyptus leaves

2.2 桉叶保护酶活性和蛋白酶抑制剂测定结果

经不同诱导处理后桉树叶保护酶活性和蛋白酶抑制剂活性测定结果见表2。结果表明：经诱导处理1 d 后，不同处理间的桉叶中PAL 活性值差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，除Y2处理活性值略有下降外，其余处理均有显著上升；不同处理间的桉叶中SOD 活性值差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，各处理均有显著上升；不同处理间的桉叶中POD 活性值差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，除Y2处理略有下降外，其余各处理均有显著上升；不同处理间的桉叶中PPO 活性值差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，各处理均有显著上升；不同处理间的桉叶中TI 活性值差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，各处理均有显著上升；不同处理间的桉叶中CI 活性值差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，各处理均有显著下降。总体而言，桉叶中PAL、SOD、POD 和PPO4 种保护酶活性较对照相比活性有显著的上升，而蛋白酶抑制剂中处理组TI 活性较对照比有显著的上升，CI 活性与对照比有显著的下降。

表2 桉叶保护酶活性和蛋白酶抑制剂活性测定及方差分析结果Table 2 Results of variance analysis and protective enzyme activity and protease inhibitor activity of Eucalyptus leaves

2.3 桉树枝瘿姬小蜂生长发育和种群指标

经不同诱导处理后，接入桉树枝瘿姬小蜂雌成虫，经一个世代（2～3 个月），观察桉树枝瘿姬小蜂子代生长发育指标，并计算种群趋势指数，结果见表3。结果表明：以不同诱导处理后桉树为寄主，不同处理间的虫瘿中桉树枝瘿姬小蜂子代出蜂数差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，除Y1处理出蜂数有上升外，其余处理均有显著下降；不同处理间的虫瘿上桉树枝瘿姬小蜂产卵刻痕数差异极显著（P＜0.01)，较对照组相比，除Y1和Y2处理产卵刻痕数有上升外，其余处理均有显著下降；不同处理间桉树枝瘿姬小蜂雌成虫怀卵量差异显著（P＜0.01)，较对照组相比，除Y2处理怀卵量变化不大外，其余处理均有显著下降。根据出蜂数、产卵刻痕数、怀卵量、雌性比等数据，计算桉树枝瘿姬小蜂存活率、达标卵量比率，并代入公式（1）中计算种群趋势指数（X13）。结果表明，经诱导处理后，桉树枝瘿姬小蜂种群趋势指数（X13）与对照组相比较有下降。

表3 桉树枝瘿姬小蜂生长发育和种群指标Table 3 Indexes of growth, development and population trend of L. invasa

2.4 不同诱导处理模糊相似优先比分析

本实验将样品测试的桉叶中营养和次生代谢物质含量，和保护酶、蛋白酶抑制剂活性值等，以及桉树枝瘿姬小蜂种群趋势指数指标做为待测数据，并进行无量纲处理。以桉树枝瘿姬小蜂产卵损伤处理（Y1）做为固定样本，其它处理做为假定样本，对数据进行模糊相似优先比分析，结果见表4 和表5。结果表明，桉树枝瘿姬小蜂产卵损伤处理（Y1）与喷施1.0 mmol·L-1Me-JA（Y6=45）诱导后，桉树叶相关化学防御物质和桉树枝瘿姬小蜂生长发育和种群动态变化较为相似，其次是喷施0.5 mmol·L-1MeJA 诱导处理（Y5=47），再次是喷施0.1 mmol·L-1诱导处理（Y4=53）。

表4 桉树枝瘿姬小蜂产卵损伤处理(Y1)与其他诱导处理样本间绝对值Table 4 Absolute values between oviposition induction treatment (Y1) and other induction treatments

表5 桉树枝瘿姬小蜂产卵损伤处理(Y1)对各诱导处理相似度Table5 Similarity between oviposition induction treatment (Y1) and induction treatment

3 讨论与结论

植物在生境中长期受到各种生物和非生物胁迫，从而逐渐形成了多种的防御反应来适应环境[19]。植食性昆虫或环境胁迫下的植物应激反应机制是研究植物与植食性昆虫互作关系的重要课题，也是目前国内外研究的热点之一[10]。诱导抗性是植物对昆虫或环境胁迫的应激反应机制，植物通过茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水杨酸（salicylic acid，SA）和乙烯（ethylene，ET）等信号途径间交叉作用，启动了植物防御反应系统，激活了相关防御基因的表达等途径来改变植物自身的化学成分，以提供植物的最佳防御体系，降低病虫危害[20-21]。研究表明桉树受桉树枝瘿姬小蜂产卵危害、机械损伤和喷施外源MeJA 等不同诱导处理后，其叶片生理生化指标产生的显著变化，结果表明，诱导处理后桉叶相关营养物质含量处理组与对照相比含量有显著下降，而次生物质中黄酮类等物质较对照相比含量有一定的上升；桉叶中PAL、SOD、POD 和PPO4 种保护酶活性较对照相比活性有显著上升，而蛋白酶抑制剂中处理组TI 活性较对照比有显著上升，CI 活性与对照比有显著下降。同时诱导处理对桉树枝瘿姬小蜂的生长发育、繁殖和种群趋势等生物学指标产生显著影响，研究结果表明经诱导处理后，桉树枝瘿姬小蜂种群趋势指数（I）与对照组相比较有下 降。

用模糊相似优先比法分析比较了桉树枝瘿姬小蜂产卵损伤诱导与其它诱导处理，对桉树叶生理生化变化和寄生的桉树枝瘿姬小蜂生长发育、种群动态影响的相似程度，结果表明，喷施1.0 mmol·L-1MeJA 诱导能够产生与桉树枝瘿姬小蜂产卵危害较为相似的结果，证明了喷施外源MeJA在诱导抗性中有积极的作用，可作为害虫综合治理的一种手段。本研究表明，桉树植株的局部损伤诱导可造成全株性的系统防御反应。植物诱导防御反应是一个复杂、有机的整体，包括诸多方面与环节，影响桉树枝瘿姬小蜂生长发育和种群动态改变的途径及机理的研究，尚待进一步研究探讨。