杉木叶片挥发物中对雀丽毒蛾的活性成分鉴定*

赖 略 徐金柱 秦长生 凌斯全田龙艳 杨 华 张春花 邱华龙

(1.河源市森林病虫害防治服务中心，广东 河源 517000; 2.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520）

杉木Cunninghamia lanceolata主要分布在中国和越南，因其生长快、易成活、材性好，是我国南方诸省主要的速生用材树种[1]。杉木病虫害的爆发是影响杉木生长和品质的重要因素之一[2]，因此，病虫害防治是杉木林经营管理的重要内容之一。雀丽毒蛾Calliteara melliCollenette 隶属于鳞翅目，毒蛾科，在中国分布于广东、广西、福建、江西、浙江、贵州、四川等主要杉木产区，主要以幼虫取食杉树针叶，严重发生时可将针叶全部食光，被害处仅留叶基部分，地面一片虫粪，严重影响杉木生长，是我国南方杉木林内重要的食叶害虫之一（图1）。近年来南方杉木林种植面积较大，该害虫在杉木主产区爆发成灾[3]。目前主要是利用化学农药对该害虫进行防治[4]，虽然保障了林产品安全，但是大量使用高毒化学农药不仅污染和破坏生态环境大量及大面积用药而且杀伤天敌、使害虫容易产生抗药性。因此，研究更为安全、高效、无残留的雀丽毒蛾防治技术势在必行。

图1 雀丽毒蛾虫态及对杉木的危害状Fig.1 Images of developmental states of C. melli Collenette and its damage symptoms to C. lanceolata

在昆虫与寄主植物的协同进化过程中，植食性昆虫主要利用密布在其触角上的气味感受器接收和识别寄主植物气味进行寄主定位、取食或产卵[5-6]。利用植食性昆虫与寄主植物的化学通讯进行害虫发生测报及防治已在农林业生产中得到了广泛的应用，并依据这种化学通讯成功开发了针对不同昆虫的高效植物源引诱剂[7]。然而，目前尚未见与雀丽毒蛾通过寄主植物的挥发性气味进行识别和定位有关的报道。本研究分析鉴定了杉木叶片的挥发性气味组成，并测试了这些挥发物对雀丽毒蛾雌雄成虫的触角电生理反应，以期为雀丽毒蛾的有效监测及防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 雀丽毒蛾采集与饲养

2020 年4—9 月在广东省韶关市曲江区小坑林场和乐昌市龙山林场采集雀丽毒蛾幼虫，将其放入养虫笼中带回实验室。再将样本置于环境条件为温度（25±1）℃、相对湿度80%左右和光周期L : D=12 h : 12 h 养虫室内，用新鲜的杉木叶片饲喂幼虫，直至其羽化出成虫。

1.2 杉木叶片挥发物的提取与鉴定

将表面洗净晾干的杉木叶片20 g 放在色谱纯的正己烷中浸泡15 min 以收集杉木叶片的挥发性物质，用无水硫酸钠去除多余水分后，用带过滤膜的移液器将样品转移到2 mL 样品瓶内，并用氮吹仪浓缩到适合的浓度，保存在-20 ℃冰箱内待用。用安捷伦气相色谱质谱联用仪（GC-MS：7890B-5977B）对杉木叶片挥发物进行分析鉴定。气相色谱GC 的型号为安捷伦7890B，色谱柱为HP-5ms 毛细管色谱柱 (长度为30 m,内径为0.25 mm，内壁的膜厚度为0.25 μm)，柱流量为1 mL/min，以99.999%高纯氮气作为载气，进样口温度为250 ℃，柱箱程序升温程序为：50 ℃保留 1 min，然后以10 ℃/min 升至250 ℃并保留1 min。进样分流比为15 : 1。MS 条件为：传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，溶剂延迟5 min，离子扫描范围50-350 m/z。C7-C40 正构烷烃混合物的样品用来计算目标化合物的保留指数，保留指数计算公式参照文献中的计算公式计算[8]。根据NIST17 谱库中的特征离子片段及化合物的保留指数对化合物进行鉴定。选取NIST 普库比对给出的化合物中匹配值最大的化合物（匹配值需大于90%）作为鉴定得到的化合物，当给出的最大匹配度仍小于90%时，将该化合物定性为未知化合物。保留峰面积大于最大峰面积的1%的峰进行化合物相对百分含量计算，同时购买标准品对已初步鉴定的部分化合物进行确认。

1.3 杉木叶片挥发物对雀丽毒蛾的触角电位测试

用气象色谱-触角电位联用仪(GC-EAD)测试雀丽毒蛾触角对杉木叶片挥发物的触角电生理反应。GC 的进样口温度、升温条件、色谱柱规格和柱流量等气象色谱条件与GC-MS 分析的相同。利用荷兰Syntech 公司的EAG 昆虫触角电位记录仪测定挥发物引起昆虫的触角电生理反应大小。首先沿蛾子触角基部将触角剪下，并在触角尖部用小刀将表皮切开一个细口，然后将触角连接到触角电位仪的两个玻璃电极上。GC 和EAD 的样品分流比为1 : 1。采用手动进样2 µL，并为不分流模式，测试蛾子的触角电生理反应。每次实验重复6 根触角以上，至少重复3 次以上都有反应的化合物质则被判定为有活性的化合物。

2 结果与分析

2.1 杉木叶片挥发物鉴定

GC-MS 分析和NIST 谱库比对表明，从杉木叶片中共分离出13 种化合物（图2），通过标准品、离子碎片信息及保留指数等信息，鉴定了其中10 个化合物，其中8 个为萜类化合物，包括2个半萜化合物，5 个倍半萜化合物，一个二萜类化合物，另外一个烷烃和一个烯烃化合物；在出峰时间为17.281、17.489 和18.171 min 的3 个峰由于和NIST 普库比对得到的相似性较低，暂时无法鉴定（表1）。所有挥发物当中，二萜化合物松柏烯的相对含量最高，为48.68%，其次依次为为α-蒎烯8.51%、β-瑟林烯7.17%、α-瑟林烯6.09%、β-榄香烯4.28%。

图2 杉木叶片挥发物的GC-MS 总离子流图Fig.2 Total Ion chromatogram of hexane extracts from C. lanceolata leaves

表1 杉木叶片挥发物组分及相对含量Table1 Compounds and relative contents of volatiles from C. lanceolata leaves

2.2 杉木叶片对雀丽毒蛾有触角电生理反应的活性物质

GC-EAD 检测结果表明，杉木叶片挥发物中有6 种化合物（P1-P3、P6、P7、P12）能引起雌雄成虫的触角电生理反应（图3）。通过保留指数和GC-MS NIST 谱库鉴定的物质进行比较，确定这6 种物质均为萜类化合物，分别为：α-蒎烯、β-蒎烯、β-榄香烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯和1-二十四烯。其中α-蒎烯、β-榄香烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯和1-二十四烯均能引起雌虫和雄虫的触角反应，但是β-蒎烯只能引起雌虫的触角反应。这6 种活性物质和谱库鉴定的化合物离子碎片对比信息如图4 所示。

图3 杉木叶片挥发物对雀丽毒蛾雌虫、雄成虫的触角电位反应图Fig. 3 Electroantennogram of antennae of C. melli Collenette to volatiles of C. lanceolata leaves

图4 对雀丽毒蛾具有电生理活性的6 种挥发物成分的离子碎片图Fig. 4 Mass spectrograms of six volatiles that induce antennal electrophysiological effect of C. melli Collenette

3 结论

目前对于雀丽毒蛾的防治措施主要包括人工防治、灯光诱杀和化学药剂防治。人工防治是根据雀丽毒蛾11 月上中旬老熟幼虫爬到树下的隐蔽场所越冬的习性进行人工摘茧。物理防治是利用该成虫有趋光性特点在成虫羽化盛期进行灯光诱杀。化学防治是在幼虫低龄期利用苦参碱或溴氰菊酯等化学药剂进行喷雾防治[4,9]。由于越冬幼虫比较隐蔽，不易发现，人工防治比较费时费力。在杉木林区灯诱时发现，杉梢小卷蛾的趋光性较强，而雀丽毒蛾趋光性较弱，每次能诱集到很多杉梢小卷蛾，而只能诱集到零星几头雀丽毒蛾，因此推测利用诱杀灯光对雀丽毒蛾引诱效果不理想。利用化学防治虽然短期内会有一定效果，但是杉木林面积较大，且地形较复杂，大面积喷洒化学药剂成本较高，而且会对生态污染造成破坏。综上所述，有必要开发针对性较强的、可用于雀丽毒蛾监测和防治的引诱剂研发。

本研究发现杉木叶片挥发性化合物主要为萜类化合物，而且以倍半萜化合物的数量最多，其中，二萜化合物松柏烯的相对含量高达48.68%，其次为α-蒎烯和β-瑟林烯等其它萜烯类化合物。本研究首次报道松柏烯在杉木叶片中存在，而且相对含量最高，但是未明确其对雀丽毒蛾有活性。松柏烯是松节油、五针松松脂、云南红豆杉内生真菌的主要次生代谢产物[10-12]。松柏烯不仅是香料的提取原料，而且对白色念珠菌、金黄色葡球菌、枯草杆菌等致病真菌及癌症具有一定的抑制作用[12-13]。

在所有挥发物中，有6 种萜烯类挥发物能够引起雀丽毒蛾成虫的触角电生理反应，其中β-蒎烯只引起雌虫的触角电生理反应，而对雄虫没有触角反应。萜烯类化合物是植物芳香性气味的主要成分，对植食性害虫及害虫天敌的行为具有重要的调控作用[14-15]。本研究筛选的对雀丽毒蛾成虫具有触角电生理活性的化合物，可以作为雀丽毒蛾引诱剂的重要候选物质。其中β-蒎烯只引起雌虫的触角反应，可以作为对雀丽毒蛾雌雄成虫具有特异性的引诱剂开发候选物质，以用于不同性别虫态的精准监测。