藻栖桔绿木霉中一个三醇类新化合物的分离鉴定与生物活性研究

刘向红，季乃云

(1.中国科学院烟台海岸带研究所，山东 烟台 264003；2.中国科学院大学，北京 100049)

木霉(Trichodermaspp.)在分类学上属于子囊菌门，是世界性分布的丝状真菌。该属真菌能够通过重寄生、产生抗性分子、竞争营养和空间、诱导植物抗性等作用机制抑制植物病原真菌，是重要的农业生防真菌资源，受到广泛关注[1-2]。木霉次生代谢产物结构多样，涵盖萜类、甾体类、聚酮类、生物碱类、肽类等多种类型[3]。近年来，作者所在课题组[4-10]开展了海洋来源木霉次生代谢产物的系统研究，发现了一系列分子多样性丰富、生物活性良好的天然产物分子。藻栖真菌桔绿木霉(Trichodermacitrinoviride)A-WH-20-3是从松节藻科海洋红藻冈村凹顶藻(Laurenciaokamurai)中分离得到的一株内生真菌。2020年，作者[9]曾对其次生代谢产物的化学成分进行了研究，发现了2个新的环橙花烷倍半萜衍生物和一个新的苯基异香豆素衍生物，在此对其次生代谢产物进行进一步研究。在批量发酵的基础上，用有机溶剂提取获得粗提物；利用硅胶柱层析、RP-18反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备薄层层析、高效液相色谱等手段从粗提物中分离获得一个新化合物；利用一维/二维核磁共振、高分辨质谱、红外光谱等谱学技术对其结构进行鉴定；并对其生物活性进行测试。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

硅胶柱层析填料(100～200目、200～300目)、薄层层析(TLC)硅胶检测板、制备薄层层析硅胶(GF254)，青岛海洋化工厂；反相硅胶柱层析填料RP-18，YMC公司；凝胶柱层析填料Sephadex LH-20，GE公司。

高效液相色谱洗脱剂，色谱纯；其余有机试剂均为分析纯，上海国药化学试剂有限公司。

SGW-3型旋光仪；Nicolet iS50型红外光谱仪；Bruker Avance Ⅲ 500型核磁共振仪(1HNMR为500 MHz,13CNMR为125 MHz)；Agilent G6230 TOF型质谱仪、高效液相色谱仪(1260 infinity四元泵，1260 infinity二极管阵列检测器，Eclipse SB-C18反相柱)，Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株发酵

桔绿木霉A-WH-20-3的菌株信息、发酵条件均参照文献[9]。

1.2.2 发酵产物的分离

桔绿木霉A-WH-20-3发酵产物的初步分离参照文献[9]。在批量发酵的基础上，用有机溶剂提取获得粗提物；组分Fr.5经RP-18反相硅胶柱层析(洗脱剂甲醇-水，体积比为9∶11)、Sephadex LH-20凝胶柱层析(洗脱剂甲醇)、制备薄层层析(展开剂二氯甲烷-甲醇，体积比为10∶1)及高效液相色谱[流动相乙腈-水，体积比为(1～2)∶3，梯度洗脱]分离，得到一个新化合物(9.5 mg)。

1.2.3 新化合物的结构鉴定

运用HR-ESI-MS、IR、HSQC、1HNMR、13CNMR、COSY、HMBC等谱学技术对新化合物的结构和相对构型进行鉴定。

1.2.4 新化合物的生物活性测试

参照文献[5,10]方法测试新化合物的抗弧菌活性及抑微藻活性。抗弧菌活性测试实验的供试弧菌为副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和灿烂弧菌(V.splendidus)；抑微藻活性测试实验的供试微藻为东海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、赤潮异湾藻(Heterosigmaakashiwo)、海洋卡盾藻(Chattonellamarina)和剧毒卡尔藻(Karlodiniumveneficum)。

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

HR-ESI-MS谱给出的加钠离子峰m/z为225.146 2[M+Na]+(计算值为C11H22O3Na,225.146 7)，提示其分子式为C11H22O3，不饱和度为1。

IR谱在νmax为3 386 cm-1、2 935 cm-1、2 883 cm-1、2 855 cm-1、1 617 cm-1、1 450 cm-1、1 384 cm-1、1 031 cm-1、965 cm-1处有吸收峰，其中3 386 cm-1处的吸收峰提示分子中可能存在羟基，1 617 cm-1处的吸收峰提示分子中可能存在双键，965 cm-1处的吸收峰提示分子中存在反式双键。

结合HSQC谱的分析，13CNMR数据(DMSO-d6中，表1)显示11个碳信号，根据DEPT信号，分别归属于2个甲基、4个亚甲基(含1个连氧)、5个次甲基(含2个连氧、2个sp2)，其中低场处δC124.0和δC131.6的次甲基信号提示存在一个双键基团。1HNMR数据(DMSO-d6中，表1)显示2个甲基双峰，4个多重峰分别对应1个氧化亚甲基和2个氧化次甲基，2个双重峰和1个三重峰对应3个活泼氢，2个多重峰对应2个烯氢。通过与文献[11]报道的化合物(3S,5S,8E)-1,3,5-trihydroxy-8-decene的波谱数据比对，发现新化合物多1个甲基(C-11)和1个次甲基(C-2)、少1个亚甲基。因此，初步推断新化合物为1,3,5-trihydroxy-8-decene的甲基化衍生物。

表1 新化合物的13CNMR(125 MHz)和1HNMR(500 MHz)数据(DMSO-d6和CD3OD)

COSY谱(图1)显示，甲基(C-11)和次甲基(C-2)相关，提示它们直接相连。HMBC谱(图1)显示，甲基(C-11)与C-1、C-2、C-3相关，提示异丁基基团的存在。COSY谱显示，OH-1/H-1相关和OH-3/H-3相关，提示1,3-二羟基异丁基单元的存在，鉴于H-3/H-4/H-5/H-6/H-7相关，该结构单元被延伸至C-7，并且OH-5/H-5相关提示C-5连接1个羟基基团。剩余部分的连接性通过HMBC谱中H-6与C-8相关、H-7与C-8、C-9相关、H-10与C-8、C-9相关确证。此外，HMBC谱中OH-1与H-1、H-2相关，OH-3与H-2、H-3、H-4相关，OH-5与H-4、H-5、H-6相关，进一步证实了新化合物为2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇。

图1 新化合物的关键COSY和HMBC相关

与文献[11]比对发现，C-8(δC131.6)和C-9(δC124.0)的化学位移提示该双键具有反式构型，这与IR谱中965 cm-1处吸收峰归属一致。

13CNMR数据(DMSO-d6和CD3OD中，表1)中C-3和C-5的化学位移提示与它们相连的2个羟基基团为反式(anti-diol)[12]。将1HNMR数据(CD3OD中，表1)与已知化合物heptantetrol的数据[13]进行比对，确定手性中心C-2与C-3的相对构型。因此，新化合物的相对构型为2S*、3S*、5R*、8E，命名为(2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇，其结构式如图2所示。

图2 (2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇的结构式

2.2 生物活性测试

弧菌是海水养殖中重要的病原微生物，而海洋赤潮微藻引起的有害藻华也严重威胁着近海水产养殖业。因此，对新化合物(2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇进行了抗弧菌和抑微藻活性测试，结果见表2。

表2 (2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇的抗弧菌和抑微藻活性

由表2可知，新化合物(2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇在用量为50 μg/片时对哈维氏弧菌和灿烂弧菌均具有弱抗菌活性，抑菌圈直径分别为6.0 mm和7.5 mm；在用量为100 μg·mL-1时对赤潮异湾藻具有较强的抑制作用，抑制率达到85%。

3 结论

从海洋红藻冈村凹顶藻内生的一株桔绿木霉A-WH-20-3的次生代谢产物中分离得到一个三醇类新化合物，运用现代谱学鉴定技术，确定其为(2S*,3S*,5R*,8E)-2-甲基癸-8-烯-1,3,5-三醇。当其用量为50 μg/片时对哈维氏弧菌和灿烂弧菌具有弱抗菌活性，抑菌圈直径分别为6.0 mm和7.5 mm；当其用量为100 μg·mL-1时对赤潮异湾藻具有较强的抑制作用，抑制率达到85%。