复方氧化锌搽剂微生物限度检查方法学研究

李立娜（天津中医药大学附属北辰中医医院，天津 300400）

复方氧化锌搽剂是天津市儿童医院的院内制剂品种，该制剂由氧化锌、氯霉素、醋酸曲安奈德及植物油组成，具有对皮肤保护和收敛的功效，用于治疗化脓性皮肤病、脓泡病、毛囊炎、病毒性皮肤病、带状疱疹、单独疱疹急性渗出性湿疹、过敏性皮肤病等[1]。笔者根据《中国药典》2020年版四部附录“非无菌产品微生物限度检查”项下规定，建立了该制剂微生物限度检查方法[2]。通过试验发现，该制剂具有极强的抑菌作用且不易消除，本文通过联合采用不同的处理方法，可有效消除其抑菌性，使检测结果更接近于该制剂的真实染菌状态，客观地反映了其微生物污染程度。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LMQ.C新华立式灭菌器、天马TD10002电子天平、DHG-9203A鼓风干燥箱、GHX-9270B隔水式恒温培养箱、LRH-250生化培养箱。

1.2 材料 培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，均购自北京三药科技有限公司，卵磷脂（Sigma公司），聚山梨酯80（天津市科密欧化学试剂有限公司），均已通过培养基适用性检查并在有效期内使用。

试验菌株：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]（均来源于中国食品药品检定研究院），菌株代次为第3代。

样品：复方氧化锌搽剂（天津市儿童医院，规格为30g，批号20210601、20210602、20210603）。

2 方法与结果[3-4]

2.1 溶液制备

2.1.1 供试液制备 取本品2瓶，混匀，称取10g，加至溶化的5g司盘80、10g聚山梨酯80和3g单硬脂酸甘油酯无菌混合物中，充分乳化，加含有5%聚山梨酯80与0.5%卵磷脂的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，混匀，作为1∶10供试液。取1∶10供试液10ml，加含有5%聚山梨酯80与0.5%卵磷脂的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，混匀，作为1∶100供试液。

2.1.2 菌液制备 按《中国药典》2020年版四部附录1105项下方法，分别制备每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液，备用。

2.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验及结果

2.2.1 需氧菌总数 取2.1.1项下1∶100供试液1ml，用100ml含2%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释，全量薄膜过滤，同时用800ml含2%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分8次冲洗，并在最后一次冲洗液中加入制备好的枯草芽孢杆菌1ml（50-100cfu），取膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，设定温度为32.5℃，培养3天；按上述方法同法操作金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。同法测定菌液组和供试液对照组菌落数。

2.2.2 霉菌和酵母菌总数 取2.1.1项下1∶10供试液9.9ml，分别加入制备好的不大于1000cfu的白色念珠菌、黑曲霉两种试验菌各0.1ml，混匀，取1ml注入平皿中，平行制备两皿，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝，设定温度为22.5℃，培养5天，测定试验组菌落数，同法测定菌液组和供试品对照组菌落数。

2.2.3 回收率 按《中国药典》2020年版四部1105项下规定，回收率=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数，回收率比值应在0.5-2之间。试验结果显示，各试验菌回收率比值均达到试验要求。结果见表1、表2。

表1 1:100供试液需氧菌总数回收率比值

表2 1:10供试液霉菌和酵母菌总数回收率比值

2.3 控制菌方法适用性试验及结果

2.3.1 铜绿假单胞菌 取1∶10供试液10ml置于1500ml含有5%聚山梨酯80和0.5%卵磷脂胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入铜绿假单胞菌1ml（10-100cfu），混匀，32.5℃下培养18小时，作为供试品组。同时以10ml pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液代替供试品，同法制备铜绿假单胞菌阴性对照组。另取铜绿假单胞菌1ml（10-100cfu），同法操作，作为阳性对照组。取上述培养物分别划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，32.5℃下培养18小时后观察。

2.3.2 金黄色葡萄球菌 取1∶10供试液10ml，每1ml分别用100ml含2%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释，全量薄膜过滤，同时用800ml含2%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分8次冲洗，并在最后一张膜上最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌1ml（10-100cfu），取10张膜置于同一1000ml含有5%聚山梨酯80和0.5%卵磷脂胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，32.5℃下培养18小时，作为供试品组。同时以10ml pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液代替供试品，同法制备金黄色葡萄球菌阴性对照组。另取金黄色葡萄球菌1ml（10-100cfu），同法操作，作为阳性对照组。取上述培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，32.5℃下培养18小时后观察。

2.3.3 控制菌检查结果 阳性对照组与供试品组均有菌生长，阴性对照组无菌生长，菌落形态符合相应菌落特征。结果见表3。

表3 控制菌检查结果

2.4 试验结果 结果表明，复方氧化锌搽剂可以采用中和法、培养基稀释法联合薄膜过滤法测定需氧菌总数，采用中和法测定霉菌和酵母菌总数，采用中和法联合培养基稀释法测定铜绿假单胞菌，采用中和法、培养基稀释法联合薄膜过滤法进行金黄色葡萄球菌检查。采用该方法对3批样品进行微生物限度检查，结果均符合规定。结果见表4。

表4 复方氧化锌搽剂微生物限度检查结果

3 讨论

氯霉素属广谱抑菌抗生素，广泛应用于各种敏感菌感染的治疗，氧化锌具有收敛和抑菌作用。该制剂品种广泛应用于临床，两种成分制备的复方氧化锌搽剂具有极强的抑菌性。笔者查阅文献，暂未发现同时消除上述两种成分抑菌性的微生物限度检查方法的文献报道。本文研究发现氯霉素采用稀释法或薄膜过滤即可消除其抑菌性；氧化锌因为是固体，必须联合采用中和法才可有效消除其抑菌性，单独采用某一种方法，均无法有效消除其抑菌性，必须联合多种方法。该方法结果准确可靠，可作为该品种的微生物限度检查方法，同时对药检人员具有一定的参考价值。