BTBR自闭症小鼠免疫异常研究进展①

李 萌 申 晨 曹 霞 （昆明医科大学第二附属医院中心实验室，昆明650101）

自闭症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASD）是一种常见的神经发育障碍性疾病，临床表现为社交、沟通缺陷和刻板行为增加。目前，我国学龄期儿童ASD 患病率约为0.7%（1/142），男女比例为4.1：1，男性患病率显著高于女性，据此估算，我国6～12 岁儿童中ASD 患病人数高达70～100 万［1］。越来越多的证据表明，免疫功能异常与ASD 患者行为异常及认知受损相关，免疫功能障碍和神经发育障碍紧密关联［2］，但其免疫失调的机制尚未阐明，阻碍了深入理解ASD 发病机制、寻找潜在预防及治疗策略的进程。特发性ASD 动物模型BTBR-T（+）tf/J（BTBR）小鼠可用于ASD 免疫失调研究，为ASD 生物学研究提供了可能。BTBR 小鼠是一种近交系小鼠，不仅具有与ASD 患者相似的行为学特征（如社交能力下降、重复性自我修饰行为增加），也表现出与ASD 患者相似的持续性免疫系统失调，一直被认为是研究ASD 较适合的临床前模型。本文总结了近年对BTBR 小鼠模型免疫系统失调的研究结果，为利用BTBR 小鼠研究ASD 病理机制提供了重要线索。

1 细胞因子表达异常

细胞因子失调对中枢神经系统功能的影响一直是神经发育障碍研究的热点。2019年发表的一篇回顾研究系统性总结了1 393 例ASD 患者细胞因子的变化，发现ASD 患者血浆中IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-12（p40）等多种细胞因子水平显著升高，且部分细胞因子水平提高与患者沟通障碍和异常行为损伤程度相关［3-4］。与ASD 患者研究结果类似，BTBR 小鼠体内细胞因子水平也明显升高。BTBR 小鼠全脑中细胞因子IL-33、IL-18、IL-1β、IL-10、IL-6 表达明显高于B6 小鼠，黑质和小脑区域表达差异最为显著，且大脑中IL-33 增多与BTBR 小鼠异常行为模式相关［5］。研究证明，抑制IL-6 过度分泌可增加BTBR 小鼠大脑皮层突触神经元谷氨酸释放，可能对ASD 患者异常社会行为有选择性治疗作用，为ASD治疗提供了新的免疫学思路［6］。

2 免疫细胞亚群异常

2.1 T 淋巴细胞亚群异常 多项研究证实，ASD 患者体内普遍存在T 淋巴细胞异常。ASHWOOD 等［7］2011 年发现，ASD 患者CD3+、CD4+和CD8+T 细胞表达活化标志CD134 和CD25 频率显著降低，且评估了70 例ASD 患儿与35 名年龄匹配的正常发育对照组循环血细胞数量和表型的差异，发现与对照组相比，ASD 组一些细胞激活标志物，包括T 细胞上的HLA-DR 和CD26，以及B 细胞上的CD38 水平均显著升高［8］。2019 年一项研究也证实，ASD 患儿外周血Th17细胞表达明显增高，而Treg细胞及相关转录因子（Foxp3）和细胞因子（TGF-β 和IL-10）水平却明显下调［9］。

研究者们评估了BTBR 小鼠外周免疫器官（脾脏、肠系膜淋巴结和外周血）中的免疫细胞类型和比例，发现BTBR 小鼠肠系膜淋巴结中CD8+T 细胞数明显多于B6 小鼠，且外周血和肠系膜淋巴结中CD4+T 细 胞 数 和 比 例 也 明 显 升 高［5］。BAKHEET等［10］研究发现，与B6 对照组相比，BTBR 小鼠CD4+T细胞转录因子Foxp3 表达较低，而RORγt、T-bet 和GATA-3 水平较高。BTBR 小鼠与ASD 患者体内存在相似的T 细胞异常，这些变化可能参与了ASD 病理过程。降低BTBR 小鼠外周和脑内Th17 免疫应答（CD4+T细胞中STAT3、RORC、IL-17A和IL-23R表达）可明显改善BTBR小鼠ASD样症状［11］。

2.2 M1型巨噬细胞偏斜 巨噬细胞是天然免疫的重要组成部分，巨噬细胞在体内可能发生经典的M1型活化和替代的M2型活化。M1型巨噬细胞释放大量细胞因子，细胞免疫效应增强，产生高水平的IL-12和低水平的IL-10。相反，M2 型巨噬细胞具有更高的吞噬活性，释放的IL-12 水平很低，同时产生大量IL-10 和TGF-β［12］。而ASD 患者体内促炎细胞因子（IL-6、IL-12、IFN-γ）表达增加，抗炎细胞因子（IL-10、TGF-β1）表达减少，说明患者可能处于过度免疫状态［13］。研究者在BTBR 小鼠中也发现类似反应，暴露于脂多糖后，与C57小鼠相比，其巨噬细胞产生的IL-12 显著增多，而IL-10 则明显减少，提示BTBR 小鼠体内存在明显的M1 型巨噬细胞偏斜，且M1 型巨噬细胞因子产生增加与小鼠严重行为损伤有关［14］。此外，M1 型巨噬细胞极化与多种神经系统疾病有关，包括多发性硬化和阿尔茨海默病［15］。最近一项研究发现，高盐可导致M1 型促炎巨噬细胞过度活化，M2 型调节性巨噬细胞下调，提示母体高盐摄入与子代ASD发生有关［16］。

2.3 脑区免疫细胞异常 虽然大脑被认为拥有“免疫特权”，但过去十年，外周炎症通过多种机制影响中枢神经系统的现象越来越明显。小胶质细胞约占大脑细胞的10%，起常驻免疫哨兵作用，是大脑炎症的关键细胞参与者。据报道，与对照组相比，ASD 患者额岛叶和视皮层小胶质细胞密度提高，且整个大脑皮层都可能存在这种变化［17］。与人类相似，2019 年一项研究发现，BTBR 小鼠比C57 小鼠海马中激活了更多小胶质细胞［18］。同时，研究者在BTBR 小鼠丘脑后外侧核、海马裂和第三脑室的血管周围观察到大量肥大细胞，推测肥大细胞有侵入脑实质的趋势。大脑中小胶质细胞和树突状细胞数也明显高于B6小鼠［5］。这些发现为BTBR 小鼠大脑炎症发生提供了依据。

3 IgG水平异常

研究表明，ASD 患者大脑和外周均存在持续性炎症反应［19-20］。BTBR 小鼠与ASD 患者发生了极为相似的免疫炎症变化，与B6小鼠相比，BTBR小鼠外周血IgG及脑反应性IgG（抗脑抗体Abs）表达明显上调。对神经系统产生特异性自身抗体是自身免疫性神经系统疾病的主要特征之一。研究者用ELISA测定了BTBR 小鼠大脑区域IgG 沉积量，发现BTBR小鼠大脑中IgG 含量明显高于B6 小鼠，且黑质和海马差异较为显著［5］。此外，BTBR 小鼠血清IgG1、IgG2b、IgG3水平也明显高于社会化FVB 小鼠，导致其IgG1/IgG2b升高。BTBR 小鼠全脑匀浆中脑反应性IgG 含量也高于FVB 小鼠，纹状体和黑质区最为明显［21］。而BTBR小鼠高水平的IgG和抗脑抗体（Abs）并非由于其分泌IgG 的B 细胞增加所致，BTBR 小鼠B细胞比例明显低于B6小鼠［22］。

4 母体免疫激活（maternal immune activation，MIA）

尽管ASD 患病率不断升高，但病因仍不清楚。虽然遗传因素在ASD 病因中起重要作用，但环境影响，尤其是在妊娠期，母体环境变化也可促发ASD。流行病学研究表明，怀孕早期母体免疫激活（母体感染）与胎儿ASD 患病风险增加密切相关［23］。据报道，妊娠中期升高的趋化因子和炎症细胞因子水平与儿童ASD 高度相关［24］。将两个自交系（即C57 和BTBR）的怀孕母鼠暴露于病毒模拟多聚肌苷酸（poly I：C）中，发现BTBR 小鼠MIA 效应比C57 小鼠更为明显，幼鼠超声发声行为增加，重复理毛和掩埋行为更严重，且产生更多的IL-6、IL-17、IL-10 和TNF-α。研究表明，遗传倾向（BTBR 种系）和环境因素（感染）协同作用导致的行为损伤比任意一个因素导致的更严重，因此，ASD 患者的复杂行为模式可能是遗传、环境等因素叠加所致［25］。进一步研究发现，将BTBR 胚胎移植到健康的B6 雌鼠可改善BTBR幼崽社会行为，而把B6胎鼠胚胎移植到BTBR母鼠，以及把从BTBR 血清中纯化的IgG 注射到B6妊娠母鼠，均会导致幼鼠社会化行为缺陷［26］。此外，其他MIA 模型后代也表现出与ASD 患者相似的行为缺陷和类似BTBR 小鼠的免疫失调，提示免疫系统与中枢神经系统发育相关［27］。

5 小结

越来越多的研究发现，ASD 患者普遍存在免疫系统异常，包括大脑持续性炎症反应、外周血炎症因子水平升高、脑特异性自身抗体增加和免疫细胞功能改变。这些免疫失调与ASD 核心特征的行为损伤增加相关，尤其是社会交往和沟通缺陷［28］。BTBR 小鼠作为目前描述最多的ASD 动物模型之一，与ASD 患者具有相似的母体免疫异常和体内免疫水平紊乱，为ASD 研究提供了可能，解决了由于机制模糊而导致ASD建模困难的问题。

BTBR 小鼠具有多个与ASD 患者相似的行为学和免疫学特征，研究BTBR 小鼠的免疫异常有助于理解其在行为异常发展中的作用，为ASD 临床治疗提供了免疫学思路。未来研究应把免疫系统和神经系统的相互作用以及神经炎症对神经发育障碍的作用结合考虑，更深入地阐明免疫系统在ASD 发展中的作用。