单细胞水平解析中性粒细胞异质性的研究进展①

谢雪梅 任 仟 罗鸿博 马凤霞 （中国医学科学院血液病医院，中国医学科学院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，国家血液系统疾病临床医学研究中心，细胞生态海河实验室，天津300020）

近年来，越来越多的研究证明中性粒细胞具有异质性，全面、深入地解析细胞的异质性需要了解群体中每个细胞基因表达的详细信息［1-3］。但是，传统的批量测序会同时处理成千上万个细胞，得到群体基因表达的平均值。单细胞水平的转录组测序技术可以揭示每个细胞的转录组表达，通过找到细胞的特异高表达基因，进一步挖掘已知细胞类型的异质性甚至发现全新的细胞类型［4-5］。而且，单细胞转录组测序数据分析的过程可以对细胞进行无监督分群，这种新型的减少人为因素干扰的分群方法可以用统一及严格的原则定义不同的免疫细胞类型和不同免疫应答下的细胞状态［6］。因此，从单细胞水平研究中性粒细胞生理及病理条件下的异质性，揭示各发育阶段、各器官中性粒细胞亚群及其演变关系，将推动整个中性粒细胞领域的发展，甚至发现新的中性粒细胞亚型。近年来，中性粒细胞异质性的研究取得了显著进展，本综述将总结中性粒细胞异质性的进展并重点阐述在单细胞水平解析中性粒细胞异质性的研究，最后讨论中性粒细胞产生异质性的可能机制。

1 中性粒细胞发育、成熟、衰老及死亡

中性粒细胞来源于骨髓中的造血干祖细胞，一个正常成人骨髓每天产生1×1011～2×1011个中性粒细胞，而一只成年小鼠骨髓每天产生1×107个中性粒细胞［7］。中性粒细胞的成熟经历了从原始粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状核和分叶核细胞的过程。原始粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞均可以通过有丝分裂而增殖，晚幼粒细胞、杆状核和分叶核细胞不能进行有丝分裂［8］。

在中性粒细胞的不同发育阶段，有不同的颗粒出现，这些颗粒中含有特定的蛋白来发挥生物学效应［9-10］。原始粒细胞无颗粒形成，早幼粒细胞出现嗜天青颗粒（初级颗粒）。中幼粒和晚幼粒细胞出现特异颗粒（二级颗粒），而明胶酶颗粒（三级颗粒）在晚幼粒细胞向杆状核转变过程中形成，分泌微泡仅存在于分页核细胞中。嗜天青颗粒含有丰富的髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和一系列抗菌肽。另外，嗜天青颗粒包含丝氨酸蛋白酶如蛋白酶3（proteinase 3，PR3），组织蛋白酶、弹性蛋白酶（neu‑trophil elastase，NE）等，以上蛋白酶除了能够水解细胞外基质成分，还具有杀菌功能［11］。更有意思的是，发现蛋白PR3 和NE 通过剪切caspase 3 和焦亡的执行蛋白Gasdermin D 在中性粒细胞死亡中发挥重要的作用［12-13］。乳铁蛋白是特异颗粒的主要成分，通过结合铁离子，能破坏细菌壁从而具有直接的杀菌活性。特异颗粒的另一成分是中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase as‑sociated lipocalin，NGAL），与乳铁蛋白具有协同抗菌作用。明胶酶颗粒的主要成分有明胶酶和精氨酸酶。关于中性粒细胞颗粒蛋白的形成，目前研究者们公认的解释是“生物合成的时间决定（targeting by timing of biosynthesis）”假说［14］。该假说认为同一颗粒中的不同颗粒蛋白同时开始合成，同时合成结束，即同一发育阶段产生的颗粒蛋白会储存在相同的颗粒里。

成熟的中性粒细胞从骨髓内被释放至外周血受基质来源的细胞因子（stromal derived factor-1，SDF-1）及其受体CXCR4调节，骨髓成熟中性粒细胞中低表达CXCR4，从而被动员到外周血。而衰老的中性粒细胞上调表达CXCR4［15］。目前研究者们认为衰老的中性粒细胞是一个具有特定表型的中性粒细胞亚群，它们下调表达L-选择素，细胞体积变小及分叶核增多，整合素激活增加、形成胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）的能力增强［16］。有意思的是，中性粒细胞的衰老受昼夜节律的影响，早上8：30（zeitgeber time 13，ZT13）机体外周血的衰老中性粒细胞数量最少，中午12：30（ZT5）外周血中衰老中性粒细胞数量最多［17］。研究人员还发现微生物可以通过Toll样受体和MyD88介导的信号途径诱导中性粒细胞衰老，清除微生物能够显著减少循环中衰老的中性粒细胞数量，并能够改善感染引起的器官损伤［18］。循环中衰老的中性粒细胞最终被募集到骨髓从而被骨髓巨噬细胞清除，细胞衰老可能是中性粒细胞异质性形成的原因之一。

中性粒细胞最显著的特征是寿命短，一般认为中性粒细胞在血液循环中的寿命只有7～20 h，但是，最近的一项研究表明人的中性粒细胞在体内可以存活5.4 d［19］。长期以来研究者普遍认为中性粒细胞自发死亡的方式是凋亡，最近发现中性粒细胞的自发死亡方式还有裂解性死亡，而且受Gasdermin家族蛋白的调控［13］。中性粒细胞死亡方式和速率的不同也可能是中性粒细胞异质性形成的原因，而且，通过单细胞转录组测序，本课题组发现中性粒细胞自发死亡过程中可以产生不同的亚群，这些亚群特异高表达的基因可富集到不同的死亡信号通路。

2 生理状态下中性粒细胞的异质性

生理状态下，除了骨髓、外周血、脾脏和肺，其他组织的中性粒细胞数量较少。骨髓储存了大量的成熟中性粒细胞，这些细胞在组织损伤或急性炎症时被大量动员至外周血，进而到达外周组织发挥作用。KIM等［20］采用流式分析在骨髓中发现了一群中性粒前体细胞，这群细胞的表型为lin-c-Kit+CD11b+Ly6GloLy6BintCD115-Gfi1+，被命名为NeuP，具有增殖潜能，在体内、体外均能分化为成熟的中性粒细胞并能发挥杀菌功能。在小鼠的肺脏，大部分中性粒细胞位于肺毛细血管的边缘，微生物感染时它们能快速被趋化至感染部位［21］。在小鼠脾脏中，不成熟的中性粒细胞是不能游动的，而成熟的中性粒细胞在红髓发挥侦察兵的作用。更有意思的是，在人脾脏的边缘区，中性粒细胞获得了能刺激B 细胞产生免疫球蛋白的特征，被称为辅助B 细胞的中性粒细胞［22］。以上研究说明组织中的中性粒细胞具有免疫哨兵的作用并获得了组织特异的特征，骨髓、外周血、脾脏和肺脏的中性粒细胞之间的异同点和相互关系还是未知。

本课题组对小鼠生理状态下的骨髓、外周血和脾脏的中性粒细胞进行了单细胞RNA 测序，并结合生物信息学方法建立了生理状态下中性粒细胞转录组图谱［23］。按照发育成熟的顺序，骨髓中的中性粒细胞可以分为5 群，包括3 个处于分裂阶段的亚群（G0、G1、G2）和2 个分裂后的较成熟亚群（G3、G4）。还分析了外周血及脾脏中的中性粒细胞，发现外周器官中主要存在3个具有不同转录组特征的成熟中性粒细胞亚群，G5a、G5b和G5c，其中，G5b高表达IFN 刺激相关基因（interferon stimulated gene，ISG），而且在脾脏中有独特的空间分布，提示该亚群可能具有不同于其他亚群的宿主防御功能。除了小鼠，本课题组还证明生理状态下人外周血也包含3个亚群，以及人G5b也高表达ISG。

传统的观点认为中性粒细胞颗粒蛋白的分布由合成的时间决定，但是该观点逐渐受到质疑。本课题组发现抗菌肽CAP-18的基因Camp主要表达于二级颗粒形成的G2 和G3 群，同时，基因Camp也表达于主要包含三级颗粒的G4 群。基因Lcn2是二级颗粒蛋白NGAL 的基因，也在G4细胞群高表达。明胶酶被认为仅仅存在于二级颗粒，但是，在单细胞水平明胶酶的基因Mmp8在G4 细胞群高表达，几乎不表达于G2 细胞群。根据上述颗粒蛋白基因在亚群之间表达的差异，本课题提出了颗粒蛋白产生的“分选假说”（sorting mechanism）。虽然蛋白是细胞生命活动的执行者，最近研究表明在中性粒细胞发育过程中，高达70%的基因表达和蛋白表达趋势一致［24］。

有一些研究在单细胞水平分析中性粒细胞及其前体细胞的异质性，这些研究侧重点不同，但是从不同角度解析了中性粒细胞的异质性。2016 年，OLSSON等［25］对造血干细胞（LSK），共同髓系祖细胞（CMP）粒-单核祖细胞（GMP）和CD34+LK（linageckit+）细胞进行了单细胞RNA测序，把Olsson的测序数据与本课题组数据进行了比对，证明LSK 和CMP的基因表达模式与G0 群一致，GMP 包含G1 群，而CD34+LK 细胞包含大约20%的G2 群细胞。2018 年GILADI 等［26］对骨髓中性粒细胞进行单细胞转录组分析，他们定义了两个中性粒细胞组stageⅠ和stageⅡ，把Giladi 的测序数据与本研究组的数据进行了比对，相关性分析揭示stageⅠ中性粒细胞主要是G2～G4 群，而stageⅡ中性粒细胞是G4 和G5 群的混合。2018 年，利用质谱流式和细胞增殖活性分析并结合生物信息学分析，EVRARD 等［27］发现骨髓内存在 3种中性粒细胞亚群：preNeu、immNeu和mNeu。preNeu 低表达c-Kit，具有增殖活性，表达一级和二级颗粒蛋白。immNeu 低表达CXCR2，不具有增殖活性，高表达二级颗粒蛋白。mNeu 高表达CXCR2并高表达三级颗粒蛋白。这3种中性粒细胞亚群与本课题组发现的G1/G2、G3、G4 中性粒细胞相对应。同年，借助质谱流式和单细胞RNA 测序，ZHU 等［28］在小鼠和人的骨髓鉴定了一种具有增殖活性的单能中性粒祖细胞，这种祖细胞又可以进一步分为两个细胞群，早期ckit+Gfi1lowCebpahiLy6Glow祖细胞群具有干细胞的特征而晚期ckit+Gfi1lowCebpalowLy6G+祖细胞群与EVRARD 等［27］发现的preNeu 非常相似。2020 年，KWOK 等［29］通过结合单细胞转录组学和蛋白质组学分析发现GMP 具有异质性并揭示GMP 包含一种单能中性粒前体细胞并将其命名为proNeu。proNeu 根据表型又可以分为proNeu1 亚群（CD34hiCD106-CD11blo）和proNeu2亚群（CD34loCD106+CD11bhi），基于分化等级的分析，进一步确定了pro‑Neu1 可以分化为proNeu2，ProNeu2 可以分化为pre‑Neu 和immNeu，而且proNeu 与本研究组定义的G1群具有很好的相关性。整合以上对中性粒细胞多组学的研究，按照发育成熟的顺序，骨髓中发育阶段的中性粒细胞可以分为proNeu、preNeu、immNeu和mNeu。

3 急性炎症时中性粒细胞的异质性

急性炎症时，骨髓中的中性粒细胞被大量动员至外周组织，外周组织中增加的中性粒细胞是否具有组织特异性有待深入研究。受因子G-CSF动员的人外周血含有CD66b+CD10+成熟中性粒细胞和CD66b+CD10-不成熟中性粒细胞，成熟的细胞抑制T 细胞的增殖和IFN-γ 的产生，相反，不成熟的细胞促进T 细胞的增殖和IFN-γ 的产生［30］。与G-CSF 类似，低剂量LPS 注射后3 h，人外周血循环的中性粒细胞出现3种形态和表型不同的亚群，分别为杆状核（CD16dim/CD62Lbright）、多分叶核（CD16bright/CD62Ldim）、正常分叶核（CD16bright/CD62Lbright），其中CD16bright/CD62Ldim亚群抑制淋巴细胞激活［31］。2018 年LE‑LIEFELD 等［32］发现，在急性细菌感染时，人外周血有一群CD16bright/CD62Ldim的多页核中性粒细胞吞噬细菌的能力明显低于其他细胞，相反，CD16dim的杆状核中性粒细胞吞噬较多的细菌，以上发现表明急性感染时人外周血存在抗菌能力不同的中性粒细胞亚群。

2004 年一篇研究发现小鼠体内的中性粒细胞可以分为3 种亚群，PMN-N、PMN-Ⅰ和PMN-Ⅱ，PMN-Ⅰ存在于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）抵抗的小鼠，而PMN-Ⅱ存在于MRSA 敏感的小鼠，PMN-N 存在于无细菌感染的小鼠中［33］。它们具有不同的表型：PMN-Ⅰ为CD49d+CD11b-，PMN-Ⅱ为CD49d-CD11b+，PMN-N 为CD49d-CD11b-。它们分泌的细胞因子也不同，PMN-Ⅰ主要分泌IL-12/CCL3，PMN-Ⅱ主要分泌IL-10/CCL2，而PMN-N 不分泌细胞因子。2016 年Blood 上的一篇研究证明LPS诱导的腹膜炎小鼠，循环及腹腔中性粒细胞ICAM表达增加，ICAM 阳性的中性粒细胞迁移能力不变，吞噬能力增强［34］。

为了更深入地研究急性感染对中性粒细胞亚群的影响，本研究组分离了急性腹膜炎小鼠的骨髓、外周血、脾脏及腹腔灌洗液的中性粒细胞进行单细胞RNA 测序和分析。发现在炎症状态下的中性粒细胞亚群的核心转录组特征没有改变，无新的亚群产生，也没有已有亚群的消失，但各群体的数目比例、功能特征、转录因子表达和群体转化路径等发生了明显变化。急性腹膜炎时，PMNb 亚群大量扩增，在感染的小鼠脾脏，所有中性粒细胞一致地分布于红髓，而PMNb 细胞主要定位于被膜下区域，进一步证明PMNb 亚群是独特的。有意思的是，经RNA 速度分析（RNA Velocity），炎症时immNeu到PMNa 的转变受到抑制，immNeu 主要分化为成熟的中性粒细胞。急性感染诱发中性粒细胞数量增加主要是因为更前体的proNeu 分裂增加而不是接近成熟的preNeu，而preNeu 负责稳态时大部分细胞的增殖。可能的解释是，稳态时preNeu 的增殖比例已经非常高，更前体的proNeu 分裂增加将是促进急性粒细胞产生的更有效的方式。急性炎症也能明显缩短分裂后的成熟期使骨髓的中性粒细胞快速成熟。EVRARD 等［27］也发现败血症时，preNeu 在骨髓和脾脏中扩增并可以被动员至血液等外周组织。KWOK 等［29］发现proNeu1，而非proNeu2，在败血症诱导的急性髓系造血时特异性扩增。

4 肿瘤状态下中性粒细胞的异质性

越来越多研究表明中性粒细胞在肿瘤发生、发展和转移中起着重要的作用，这些细胞被称为肿瘤相关中性粒细胞（tumor associated neutrophils，TAN）。根据TAN的表型和功能不同，可以分为抗肿瘤的N1和促肿瘤的N2 亚群［35-36］。IFN-β 和TGF-β 能分别促进TAN 极化为Nl 和N2 型。SAGIV 等［37］在肿瘤小鼠和患者的外周血中鉴定出3种不同的循环中性粒细胞群：①高密度成熟的、形态较小的抗肿瘤中性粒细胞；②低密度成熟的、形态大的抗肿瘤中性粒细胞；③低密度未成熟的、细胞较大的骨髓来源的髓系抑制细胞（G-MDSC）。低密度中性粒细胞（low density neutrophils，LDN）包括不成熟的MDSC 和在TGF-β 作用下从高密度中性粒细胞（high density neutrophils，HDN）转化而来的成熟的细胞。与HDN相比，LDN 具有弱的迁移、吞噬和活性氧产生能力，强的免疫抑制能力。其中，G-MDSC 是具有免疫抑制功能的未成熟中性粒细胞，小鼠G-MDSC 的表型是CD11b+Ly6GhiLy6Clo，人G-MDSC 的表型是CD14-CD11b+CD15+（或CD66b+）［38-40］。

研究者对不同的肿瘤中性粒细胞做了转录组测序，结果表明，TAN、G-MDSC 和幼稚中性粒细胞具备不同的基因表达谱，与TANs 相比，G-MDSCs 和幼稚的中性粒细胞非常接近［41］。TANs 显著下调与细胞毒性有关的基因，相反，许多与免疫相关的基因和信号通路，均在G-MDSC中上调，并在TAN中进一步上调。2019年，利用单细胞转录组测序，ZILIO‑NIS 等［42］绘制了小鼠和人肺肿瘤中浸润髓系细胞包括中性粒细胞的转录组图谱，发现中性粒细胞在人类肺肿瘤中有5 种亚型（hN1～5），而在小鼠肺肿瘤中形成6 种亚群（mN1～6），其中小鼠的3 种亚群（mN4～6）高表达SiglecF，它们在肿瘤中高度富集并具有促进肿瘤的特性。还发现hN1 和mN1 主要表达经典的中性粒细胞标志如MMP8、MMP9、S100A8、S100A9，而hN5 和mN5 主要表达细胞因子CCL3、CSF1。有趣的是，还发现hN2 和mN2 是特殊的亚群，它们虽然数量很少，但是高表达ISG 如IFIT1、IRF7、RSAD2。

此外，由原发肿瘤产生的细胞因子如IL-1β，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）可以诱导中性粒细胞生成促进未成熟中性粒细胞从骨髓释放到外周血和肿瘤部位［43］。不成熟中性粒细胞在肿瘤小鼠的脾脏也会扩增，因此，与炎症类似，癌症会触发一种“急性”粒细胞造血，促进中性粒细胞异质性的产生［44］。

5 中性粒细胞异质性形成的机制

在发育、成熟过程中，不同的发育阶段中性粒细胞亚群的产生，中性粒细胞自身的特征如快速衰老、生存期短和跨内皮迁移等均能导致中性粒细胞异质性的产生，微环境和疾病也能改变中性粒细胞的功能和行为。虽然目前大家认为中性粒细胞是存在异质性的，主要的争议是中性粒细胞的不同表型是否代表真正的中性粒细胞亚群，或者仅仅是不同的细胞状态。现在越来越多的证据证明，中性粒细胞的亚群和表型的变化是通过转录组和表观遗传组共同调节的。

成熟中性粒细胞具有独特的分叶核形状，每个分叶由线性的DNA 链接起来，这种致密的结构方便粒细胞的迁移以及吞噬，并且有利于NETs 的形成［46］。研究表明致密的核结构也限制了中性粒细胞转录活动，与其他髓系细胞相比，成熟中性粒细胞RNA 的含量较低。以往研究者们认为，由于转录活动的不活跃，中性粒细胞的异质性不高。但现阶段研究结果表明，中性粒细胞基因表达的重塑发生在其整个发育的过程中［47］。在中性粒细胞的成熟过程中，数百个与生物合成和增殖过程相关的基因会下调，而与颗粒合成、抗菌免疫应答等基因会上调。值得注意的是，与骨髓未成熟细胞相比，与抗病毒防御相关的基因在循环中性粒细胞会特异上调，表明即使终末分化的中性粒细胞，转录活动也是活跃的。再者，表观遗传组的变化，比如基因调控元件、组蛋白和核小体的标记也发生在中性粒细胞的发育过程中［48］。人的中性粒细胞除了转录组的差异，基因甲基化也存在差异，表明表观遗传参与中性粒细胞基因的表达调控［49］。所以，单细胞转录组测序、蛋白质学、基因组学、开放染色质学的多组学研究的兴起，可以更好、更全面地研究中性粒细胞的发育和异质性等特点。

6 总结

本综述总结了单细胞水平解析中性粒细胞异质性的研究进展，同时，发现中性粒细胞死亡过程中也存在异质性，即死亡的方式和速率不同，本课题组正在利用单细胞测序研究人和小鼠中性粒细胞不同死亡阶段的转录组特征并分析不同的中性粒细胞亚群受哪些死亡相关基因或信号途径的控制，而且将利用感染或无菌性炎症模型研究死亡方式和速率不同的细胞亚群对机体炎症程度和防御能力的影响。

由于中性粒细胞参与很多疾病的病理过程，包括急性、慢性的病原体感染、肿瘤微环境的构建和自身免疫性疾病等，并且会参与疾病治疗如放疗和化疗后的康复。所以，越来越多的研究者开始关注中性粒细胞的异质性。利用单细胞转录组测序探寻疾病状态下中性粒细胞异质性的改变将是研究热点，因为其将有助于了解疾病病理过程和寻找更特异的作用靶点，为疾病的治疗提供新思路。但是转录组的数据不能完全解释细胞功能，因为细胞功能主要由蛋白决定。所以，结合单细胞水平的转录组、蛋白组、代谢组、表观组和成像技术将会是未来的趋势，能更精确和全面地解析中性粒细胞的异质性。