miR-1307-3p通过靶向ISM1促进乳腺癌细胞的增殖和迁移

陆旭阳，刘奕，李晓辉，黄欣，黄翠霞，马书祥，窦伟瑜，曾麒燕，2△

乳腺癌发病率逐年上升，已成为女性患者癌症死亡的主要原因［1］。尽管放化疗及多种辅助治疗极大提高了患者的生存质量，但由于乳腺癌细胞的异质性，乳腺癌转移依然是目前难以攻克的问题［2］。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一种内源性非编码RNA，其通过与靶基因3′端非编码区（3′-UTR）结合而调节靶基因的表达［3］，参与细胞发育、增殖、分化和凋亡等多种生物过程［4］。研究表明，miRNA在乳腺癌的发生、侵袭及转移过程中发挥重要作用［5-6］，有望成为乳腺癌诊治的靶标。本课题组前期发现，过表达linc00324可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，减少侵袭和迁移，增加细胞凋亡；通过MS2-RIP测序发现，linc00324可与多种miRNA相互作用，其中包括miR-1307-3p［7］，但其在乳腺癌中的作用鲜有报道。本研究旨在分析miR-1307-3p对乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡等方面的影响，并初步分析其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人乳腺正常上皮细胞系MCF-10A，人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231购自中国科学院上海生命科学院细胞库。DMEM高糖培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青/链霉素双抗、胰蛋白酶购自美国Gibco公司。miDETECT A TrackTMmiRNA RT-qPCR Starter Kit、miR-1307-3p类似物（mimics）或抑制物（inhibitor）及相应的阴性序列（control）购自广州锐博公司，序列见表1。Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。RNA提取试剂盒购自美国赛默飞公司；总RNA逆转录和荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自日本DOJINDO公司；Annexin V-异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司；双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司。多功能酶标仪（Thermo公司，美国），实时荧光定量PCR仪（ABI，美国），超净工作台（苏洁医疗器械有限公司，苏州），倒置显微镜（Olympus，日本），流式细胞仪（Beckman-Coulter公司，美国）。

Tab.1 Sequence for miRNA mimics or inhibitor表1 miRNA类似物或抑制物序列

1.2 方法

1.2.1 TCGA数据库分析miR-1307-3p在乳腺癌患者中的表达水平及其与临床指标的关系 利用TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）分析miR-1307-3p在不同肿瘤中的表达水平，进一步从数据库中获取1 068例乳腺癌患者和104例正常乳腺组织的资料，分析miR-1307-3p在乳腺癌组织中的表达水平，并分析其与临床指标的关系。

1.2.2 细胞培养 将人乳腺正常上皮细胞株MCF-10A及人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231用含10%FBS的DMEM培养基，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2.3 细胞转染 MCF-7细胞以3×105个/孔接种于6孔培养板，待细胞密度为70%时，用4μg mimics、mimics-control、inhibitor和inhibitor-control进行转染，以未转染细胞作为空白对照，培养6 h后，更换为完全培养基继续培养48 h。

1.2.4 总RNA提取及qPCR TRIzol法提取转染后细胞总RNA，并逆转录成cDNA。按照qPCR试剂盒说明书进行PCR反应，检测mRNA和miRNA表达水平，分别以GAPDH和U6为内参。PCR扩增条件：95℃预变性10 min；95℃2 s，60℃20 s，70℃10 s，共35个循环。以2-ΔΔCt值表示miR-1307-3p、ISM1相对表达水平。引物由日本Takara公司合成，序列见表2。

Tab.2 Primer sequence for qPCR表2 qPCR引物序列

1.2.5 CCK-8法检测miR-1307-3p对MCF-7细胞增殖能力的影响 将转染mimics和mimics control的细胞于96孔板中分别培养24、48、72、96 h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养细胞2 h后，检测450 nm处吸光度（A）值，以此反映细胞增殖能力。

1.2.6 划痕实验分析miR-1307-3p对MCF-7细胞迁移能力的影响 MCF-7细胞以3×105个/孔接种于6孔板，按1.2.3转染。待细胞密度达90%时，用小枪头在孔中划线，PBS洗去脱落细胞后，加入完全培养基。培养24 h或48 h后，用Image J软件分析划痕愈合率。愈合率=（0 h划痕面积-24 h或48 h的划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.2.7 流式细胞术分析miR-1307-3p对MCF-7细胞凋亡的影响 收集转染48 h后的细胞，用预冷PBS洗涤后，加入AnnexinⅤ-FITC（0.5 mg/L），15 min后，加入碘化丙啶（5 mg/L），上流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.2.8 生物信息学分析 通过miRDB、miRWalk、TargetScan数据库预测miR-1307-3p的靶基因。同时，应用TCGA数据库分析乳腺癌组织中靶基因的表达水平，并分析其在不同病理分期中的表达差异。

1.2.9 双荧光素酶实验 通过PCR扩增ISM1的3′-UTR序列，克隆至pGLO质粒构建野生型质粒，并在此基础上构建3′-UTR的突变型质粒。取对数生长期MCF7细胞，接种于6孔板，培养24 h后进行细胞转染。将miR-1307-3p mimics与ISM1 3′-UTR野生型或突变型质粒共转染细胞，并以mimics control为对照。转染48 h后，参照试剂盒说明书检测各组细胞的荧光强度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-1307-3p在乳腺癌组织的表达水平显著上调 TCGA数据库分析表明，miR-1307-3p在乳腺癌组织中的表达水平最高（图1）；乳腺癌组织中miR-1307-3p的表达水平高于正常乳腺组织（11.17±0.04vs.10.38±0.11，t=6.372，P＜0.01）；有淋巴转移者miR-1307-3p表达水平低于无淋巴转移者，见表3。

Fig.1 The expression of miR-1307-3p in different tumors with analyzed by TCGA data图1 利用TCGA数据库分析miR-1307-3p在不同肿瘤中的表达水平

Tab.3 The relationship between the expression of miR-1307-3p and the clinical indicators in breast cancer patients表3 不同临床特征的乳腺癌患者的miR-1307-3p表达水平比较 （±s）

Tab.3 The relationship between the expression of miR-1307-3p and the clinical indicators in breast cancer patients表3 不同临床特征的乳腺癌患者的miR-1307-3p表达水平比较 （±s）

＊＊P＜0.01；#数据存在缺失值。

患者临床特征年龄>60岁≤60岁TNM分期#Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳ肿瘤直径#≤2 cm>2 cm淋巴转移#n miR-1307-3p相对表达量t 480 588 11.05±1.37 11.23±1.29 1.836 781 264 11.20±1.35 11.04±1.28 1.761 276 749 11.15±1.24 11.17±1.36 0.177有无547 324 11.13±1.32 11.39±1.33 3.214＊＊

2.2 乳腺癌细胞中miR-1307-3p表达变化 乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中miR-1307-3p的相对表达水平明显高于正常乳腺细胞MCF-10A，见图2。

2.3 过表达和沉默miR-1307-3p的效果 qPCR分析表明，miR-1307-3p mimics组的miR-1307-3p表达水平是mimics control组的15.13倍，而转染miR-1307-3p inhibitor后miR-1307-3p表达水平下调约57%，见图3。

2.4 过表达miR-1307-3p促进MCF-7细胞的增殖 与mimics control组相比，miR-1307-3p mimics组细胞A450值明显增高，见图4。

Fig.2 The expression of miR-1307-3p analyzed by qPCR in different breast cells lines图2 qPCR分析不同乳腺细胞株中miR-1307-3p表达量

Fig.3 qPCR verified the expression of miR-1307-3p in MCF-7 cells transfected with miR-1307-3p mimics or inhibitor图3 qPCR验证miR-1307-3p-mimics或inhibitor转染MCF-7细胞后miR-1307-3P的表达水平

Fig.4 Overexpression of miR-1307-3p promotes the proliferation of MCF-7 cells图4 miR-1307-3p过表达促进MCF-7细胞的增殖

2.5 过表达和沉默miR-1307-3p后MCF-7细胞迁移能力的变化 划痕实验显示，与空白组和mimics control组相比，miR-1307-3p mimics组在24 h和48 h的迁移能力显著增强，见图5、表4。与空白组和inhibitor control组相比，miR-1307-3p inhibitor组在24 h和48 h的迁移能力则显著减弱，见图6、表5。

Fig.5 The effects of miR-1307-3p overexpression on the migration abilities of MCF-7 cells图5 miR-1307-3p过表达对迁移能力的影响

Fig.6 The effects of miR-1307-3p silence on migration abilities of MCF-7 cells图6 miR-1307-3p沉默对迁移能力的影响

Tab.4 Comparison of migration ability in MCF-7 cells after the overexpression of miR-1307-3p表4 miR-1307-3p过表达后各组MCF-7细胞迁移能力比较（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of migration ability in MCF-7 cells after the overexpression of miR-1307-3p表4 miR-1307-3p过表达后各组MCF-7细胞迁移能力比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与mimics control组比较，P＜0.05。

组别空白组mimics control组miR-1307-3p mimics组F 24 h迁移率（%）16.87±2.97 14.13±3.22a 43.06±6.22ab 13.264＊＊48 h迁移率（%）32.51±3.26 26.28±7.39a 60.13±7.46ab 12.363＊＊

2.6 miR-1307-3p-inhibitor诱导MCF-7细胞凋亡 空白组、inhibitor control组和inhibitor组细胞凋亡 率 分 别 为（4.54±0.395）%、（4.94±0.423）%和（11.90±0.367）%，组间比较差异有统计学意义（F=107.327，P＜0.01），抑制miR-1307-3p表达后MCF-7细胞凋亡率升高，见图7。

2.7 miR-1307-3p可调控ISM1基因的表达 通过miRDB、miRWalk、TargetScan数 据 库 预 测miR-1307-3p的靶基因，发现ISM1可能是其靶基因之一，相互作用位点见图8A。双荧光素酶实验显示，与对照质粒相比，miR-1307-3p mimics与ISM1 3′-UTR野生型质粒共转染后，细胞荧光素酶活性明显下降（P＜0.01）；而miR-1307-3p mimics与ISM1 3′-UTR突变型质粒共转染后，荧光素酶活性与对照质粒相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图8B。经qPCR分析发现，miR-1307-3p过表达明显下调MCF-7细胞中ISM1的表达，沉默miR-1307-3p表达后，MCF-7细胞中ISM1的表达明显上调（P＜0.05），见图9。

Tab.5 Comparison of migration ability in MCF-7 cells after the downrgulation of miR-1307-3p表5 miR-1307-3p表达下调后各组MCF-7细胞迁移能力比较 （n=3，±s）

Tab.5 Comparison of migration ability in MCF-7 cells after the downrgulation of miR-1307-3p表5 miR-1307-3p表达下调后各组MCF-7细胞迁移能力比较 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与空白组比较，b与inhibitor control组比较，P＜0.05。

组别空白组inhibitor control组miR-1307-3p inhibitor组F 24 h迁移率（%）20.2±3.27 19.4±3.52a 11.2±2.82ab 8.373＊48 h迁移率（%）36.3±3.76 40.1±6.52a 25.1±3.46ab 11.1840＊＊

2.8 乳腺癌患者ISM1的表达水平及与病理分期的关系 进一步利用TCGA数据库分析1 085例乳腺癌组织中ISM1的表达水平，发现乳腺癌组织中ISM1的表达水平明显低于正常乳腺组织（P＜0.01），见图10A。不同病理分期乳腺癌患者的ISM1表达水平差异有统计学意义，见图10B。进一步分析发现，在乳腺癌患者中ISM1启动子的甲基化水平明显高于正常乳腺组织（P＜0.01），见图10C。

3 讨论

Fig.7 The apoptosis of MCF-7 cells after transfection with miR-1307-3p inhibitor analyzed by flow cytometry图7 流式细胞术分析miR-1307-3p沉默表达对MCF-7细胞凋亡的影响

Fig.8 Prediction and validation of the targeting relationship between ISM1 and miR-1307-3p图8 ISM1与miR-1307-3p靶向关系的预测与验证

Fig.9 miR-1307-3p regulates the expression of ISM1 gene图9 miR-1307-3p可调控ISM1基因的表达水平

Fig.10 The expression of ISM1 in breast cancer analyzed with TCGA database图10 TCGA数据库分析ISM1在乳腺癌中的表达情况

miRNA是一类长度为18~26 bp的小分子非编码RNA，通过调控基因表达，参与调节细胞增殖、分化、凋亡和代谢等各种生理和病理过程［8-9］。研究表明，miRNAs的异常表达与乳腺癌的发生发展密切相关，参与肿瘤血管形成、转移、侵袭及肿瘤耐药等过程［10］。miR-1307-3p是与癌症相关的miRNA，可促进肿瘤的增殖、转移和化疗耐药［11-13］。研究发现miR-1307-3p的表达水平在乳腺癌患者中显著上调，可用于乳腺癌的早期诊断［14］。本研究发现，TCGA数据库中miR-1307-3p在乳腺癌组织中的表达水平明显上调；进一步研究发现，miR-1307-3p在乳腺癌细胞株中的表达水平也明显升高，并促进乳腺癌细胞的增殖和迁移，miR-1307-3p抑制剂可诱导乳腺癌细胞凋亡，提示miR-1307-3p的异常表达可能与乳腺癌的发生发展有关。然而，利用TCGA数据库分析miR-1307-3p在乳腺癌患者中的表达水平时，却发现有淋巴结转移组的miR-1307-3p水平低于无淋巴结转移组的患者，这与体外实验结果矛盾，由于miR-1307-3p水平是来自数据库中的RNA芯片数据，后续的研究中将进一步收集乳腺癌组织样本，验证miR-1307-3p与淋巴结转移的关系。

目前一般认为miRNA主要通过与靶基因miRNA的3′-UTR互补结合而抑制靶基因的翻译，以调控靶基因的表达水平［15］。为探明miR-1307-3p的作用机制，首先需要寻找其靶基因。本研究通过miRDB、miRWalk、TargetScan预测ISM1的3′-UTR区存在与miR-1307-3p互补结合的位点，并通过双荧光素酶实验证实ISM1是miR-1307-3p的靶基因，与Zheng等［16］报道一致。进一步发现，过表达miR-1307-3p可下调ISM1的表达水平，抑制miR-1307-3p表达则上调ISM1的表达水平。ISM1最初被鉴定为与胚胎发育相关的基因［17］。目前关于ISM1的研究甚少，有研究报道ISM1在胆管癌患者中的水平显著下调［18］，ISM1过表达可抑制人脑胶质瘤和小鼠肿瘤的血管生成［19-20］，并抑制小鼠乳腺癌和黑色素瘤的生长［21］。也有研究发现，可溶性ISM分子通过激活caspase-8来诱导血管内皮细胞凋亡，而膜结合型ISM则通过激活黏着斑激酶促进血管内皮细胞的存活和迁移［22］。笔者通过TCGA数据库分析发现，ISM1在乳腺癌组织中的表达水平显著下调，且其表达水平与乳腺癌患者病理分期有关。最近有文献报道ISM1是NODAL信号通路的抑制剂［17］。已有研究表明NODAL通路与乳腺癌的进展相关，NODAL可通过激活ERK信号而调控c-myc和P27蛋白水平，最终导致肿瘤形成［23］。

表观遗传调控异常与肿瘤发生发展密切相关。DNA甲基化是较早发现的表观遗传学修饰之一，正常组织中分散存在的CpG通常被甲基化，而转录调控区（如启动子）的CpG岛则呈低甲基化［24］。转录调控区CpG岛的甲基化可招募特异性甲基化结合蛋白，引起DNA构象、染色质结构及稳定性的改变，从而抑制相关基因的转录，导致多种信号通路以及细胞周期、凋亡、DNA损伤和免疫识别等改变。异常DNA甲基化与肿瘤发生有关，有研究报道，卵巢癌和乳腺癌患者中抑癌基因RAS相关区域家族1A（RASSF1A）由于其启动子呈高甲基化而使其表达受抑［25］，DNA损伤修复基因谷胱甘肽巯基转移酶P1（GSTP1）启动子区域甲基化异常可缩短肝癌患者生存期［26］。本研究发现，乳腺癌患者中ISM1启动子的甲基化水平明显增强，这与Suman等［27］的研究结果一致，提示乳腺癌患者中ISM1水平下调除了受miR-1307-3p的直接调控外，还可能与其启动子甲基化有关，miR-1307-3p是否涉入其中机制，有待进一步深入研究。

综上所述，miR-1307-3p可通过靶向ISM1而促进乳腺癌细胞增殖和迁移，其中可能涉及ISM1启动子的甲基化、NODAL和ERK信号通路的激活等过程，本研究为明确乳腺癌发生发展机制提供了新思路。