miR-454-3p对鼻咽癌CNE-2细胞上皮-间质转化的调控机制

王林春 欧阳博慧 吴春龙 吴凯乐 谢晴晴 唐建

鼻咽癌是一种源于鼻咽上皮细胞的原发性恶性肿瘤，侵袭和转移是其主要生物学特性[1]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是肿瘤细胞获得间充质表型和增强侵袭能力的关键步骤。微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是包括鼻咽癌在内的多种肿瘤进展过程的关键因子[2]，参与调控EMT过程。大量研究表明，miR-454-3p在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用，例如：miR-454-3p可通过靶向活化T细胞核因子c2（NFATc2）抑制神经胶质瘤细胞增殖并增加细胞凋亡[3]，通过靶向钙结合蛋白1（CALB1）抑制非小细胞肺癌细胞增殖[4]，通过靶向B细胞易位基因 1（BTG1）增强肾癌细胞对 X线的敏感性[5]等，表明miR-454-3p可通过调控靶基因参与多种恶性肿瘤的发展进程，但目前关于miR-454-3p在鼻咽癌中的调控机制尚不清楚。因此，本研究选取鼻咽癌细胞系CNE-2为研究对象，探究miR-454-3p调控CNE-2细胞EMT的机制，为鼻咽癌细胞侵袭和转移的机制研究提供更多的实验室依据，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2017年1月至2018年12月于柳州市中医医院就诊的95例鼻咽癌患者，男71例，女24 例，年龄 27～70（46.12±9.53）岁，临床分期Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期54例。纳入标准：所有鼻咽癌患者均未接受放化疗治疗，无肝肾功能不全、神经疾病以及其他肿瘤等合并症，无家族病或特殊病史。排除标准：合并糖尿病、其他肿瘤或严重凝血功能障碍或心、肺功能不全者；患者病史资料不全，年龄＞80岁，不积极配合本研究或中途退出者。收集30例本院同期健康体检者，男 21 例，女 9 例，年龄 29～63（45.77±8.94）岁。两组对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 材料 鼻咽癌细胞系CNE-2购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基、FBS和Opti-MEM培养基购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；逆转录酶盒试剂及SYBR Green定量PCR试剂盒购自北京TaKaRa公司；pmirGLO载体、E-盒结合锌指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2,ZEB2）野生型序列（WT）及ZEB2突变型序列（MUT）、miR-454-3p mimic和对照序列（Mimic-NC）、过表达 ZEB2质粒（ZEB2 plasmid）及对照载体（vector）由上海生工生物公司合成；Trizol试剂购自索莱宝公司产品；Transwell小室购自美国Corning公司；anti-E-cadherin antibody、anti-N-cadherin antibody、anti-ZEB2 antibody、β-actin购自英国Abcam公司；anti-Vimentin antibody、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司。CO2细胞培养箱购自美国Binder公司；倒置荧光相差显微镜购自日本Olympus公司（型号：CKX53）；实时荧光定量 PCR系统购自美国Agilen公司（型号：AriaMx）；垂直电泳仪（PowerPac Basic）和蛋白转印模块（Mini Trans-Blot Cell）购自美国Bio-Rad公司；酶标仪购自美国MD公司（型号：FilterMax F3）；双荧光素酶报告基因发光检测仪购自美国Promega公司（型号：GloMax 20/20）；低温离心机购自德国Eppendorf公司（型号：5418R）；凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司（型号：Tanon 5200）。

1.3 miR-454-3p、ZEB2 mRNA的表达检测 采用RT-qPCR检测。收集鼻咽癌患者及健康体检者清晨空腹静脉血各3 ml，检测miR-454-3p水平；收集临床病理学确诊的鼻咽癌患者活检组织标本，检测miR-454-3p、ZEB2 mRNA的表达；收集经细胞裂解液处理的细胞样品，检测miR-454-3p、ZEB2 mRNA的表达。实验步骤：将上述检测样本使用Trizol法进行RNA提取，取1 μg总RNA进行逆转录获得cDNA单链，以此作为模板进行qPCR检测，miR-454-3p的内参为U6，ZEB2的内参为β-actin，扩增参数为：95℃30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 34 s，共 40 个循环，每个样品设置3个平行反应孔，实验重复3次，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 细胞分组及转染 取对数增殖期的CNE-2细胞，以每孔2×106个细胞接种于6孔板中，培养至细胞融合度达70%～90%。随机分为Control组、miR-454-3p mimic组、Mimic-NC 组、miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid组和miR-454-3p mimic+vector组。按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书要求，将miR-454-3p mimic和Mimic-NC转染至CNE-2细胞中，miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid组和miR-454-3p mimic+vector组则需额外转染ZEB2过表达质粒及对照载体，转染48 h后收集各组样品。Control组不进行任何处理。

1.5 细胞侵袭能力的测定 采用Transwell侵袭实验。将Matrigel胶铺于Transwel小室上室，置37℃培养箱24 h使Matrigel聚合成凝胶。将各组细胞消化制备单细胞悬液，将2.0×105细胞加入Transwell上室，下室加入500 μl含10%FBS的培养基，于37℃、5% CO2细胞培养箱培养过夜，次日取出，用棉签轻轻擦去上室表面的细胞，多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，PBS清洗，显微镜下计数后取平均数，检测细胞的侵袭能力，实验重复3次。

1.6 细胞迁移能力的测定 采用细胞划痕实验。细胞接种于6孔板并进行相应转染处理，待细胞融合度达约90%后，用灭菌的200 μl枪头垂直于板底均匀地划痕，用无菌PBS洗去脱落细胞，于显微镜下观察划痕处有无细胞并拍照记录，随后放回细胞培养箱继续培养24 h再次取样拍照，用Image J软件计算0 h及24 h划痕面积，实验重复3次。细胞迁移率=（T0h面积-T24h面积）/T0h面积×100%。

1.7 ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平的测定 采用Western blot法。细胞经相应转染处理后48 h收集样品，RIPA法进行总蛋白提取，BCA法定量后，取50 μg总蛋白，进行SDS-PAGE垂直电泳，将胶上的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗孵育，4℃过夜，洗去一抗，孵育对应种属HRP标记的二抗，室温1 h，洗去二抗，用化学发光显色液显色。以β-actin为内参，采用Image J软件分析并计算 ZEB2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达水平，实验重复3次。

1.8 双荧光素酶报告基因实验 CNE-2细胞用含10%FBS的DMEM培养基培养于37℃、5% CO2培养箱中。将ZEB2 3'UTR-WT及ZEB2 3'UTR-MUT构建到pmirGLO载体中，获得WT-ZEB2和MUT-ZEB2，不含任何外源片段的空载体作为阴性对照。pmirGLO载体的萤火虫荧光素酶luc2作为主要报告基因，海肾荧光素酶hRluc-neo为对照报告基因，按照LipofectamineTM2000说明书进行转染，将miR-454-3p mimic分别与WT-ZEB2和MUT-ZEB2转染到细胞中，同时以Mimic-NC作为对照。设置3复孔，转染后培养12 h，用双荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫荧光素酶活性，以海肾荧光素酶hRluc-neo的活性作为校正报告基因，实验重复3次。

2 结果

2.1 miR-454-3p的表达与鼻咽癌恶性进展的关系 鼻咽癌患者血清miR-454-3p水平为0.57±0.09，低于健康体检者的1.02±0.17，差异有统计学意义（P＜0.05）。在鼻咽癌分期中，Ⅲ、Ⅳ期患者鼻咽癌组织miR-454-3p的相对表达水平为0.48±0.09，低于Ⅰ、Ⅱ期患者的 0.98±0.18，差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ期患者鼻咽癌组织ZEB2 mRNA相对表达水平为2.12±0.53，高于Ⅰ、Ⅱ期患者的 1.06±0.19，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-454-3p与 ZEB2 mRNA的表达呈负相关（r=-0.734，P＜0.01），见图 1。

图1 鼻咽癌组织中miR-454-3p和ZEB2 mRNA关系的散点图

2.2 miR-454-3p对CNE-2细胞ZEB2的调控 双荧光素酶报告基因实验结果显示，与Mimic-NC组比较，过表达miR-454-3p可降低ZEB2 3'UTR-WT的荧光素酶活性，差异有统计学意义（P＜0.05），而不影响ZEB2 3'UTR-MUT的荧光素酶活性，差异无统计学意义（P＞0.05），见图 2。CNE-2细胞转染 miR-454-3p mimic后，与Mimic-NC组比较，miR-454-3p mimic组miR-454-3p表达水平明显升高，ZEB2 mRNA及蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但与Control组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。CNE-2细胞转染ZEB2过表达质粒后，相较于miR-454-3p mimic+vector组，miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid组中ZEB2 mRNA及蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但miR-454-3p表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）；miR-454-3p mimic组与miR-454-3p mimic+vector组 miR-454-3p和ZEB2的表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表 2、图 3。

图2 双荧光素酶报告基因实验检测结果

表2 各组细胞miR-454-3p与ZEB2mRNA及蛋白的表达水平比较

图3 Western blot检测ZEB2蛋白表达电泳图

2.3 miR-454-3p抑制EMT降低CNE-2细胞的侵袭和迁移能力 与Mimic-NC组比较，miR-454-3p mimic组N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白表达水平升高，侵袭细胞数及迁移率降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Mimic-NC组与Control组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。与miR-454-3p mimic+vector组比较，miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid组中N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平及侵袭细胞数、迁移率明显升高，E-cadherin蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；miR-454-3p mimic组与miR-454-3p mimic+vector组结果比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3、4，图4、5（见插页）、6。

图4 Western blot检测 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达电泳图

图5 Transwell侵袭实验检测 CNE-2 细胞侵袭能力结果图（a：Control组；b：miR-454-3p mimic组；c：Mimic-NC 组；d：miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid 组；e：miR-454-3p mimic+vector组；×100）

图6 细胞划痕实验检测 CNE-2 细胞迁移能力结果图（a、f：Control组；b、g：miR-454-3p mimic组；c、h：Mimic-NC 组；d、i：miR-454-3p mimic+ZEB2 plasmid 组；e、j：miR-454-3p mimic+vector组；×40）

表3 各组细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的相对表达水平比较

3 讨论

鼻咽癌是头颈部肿瘤的主要类型之一，具有明显的地理分布特征，常见于中国南部（特别是两广地区）及东南亚地区[6]，严重危害人类健康。尽管调强放疗和同步放化疗的患者健康状况得以改善，使鼻咽癌的5年局部控制率已达80%～90%，但仍有15%～30%的患者发生骨、淋巴结、肝和肺的远处转移，这些转移事件是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因[7-8]。因此，迫切需要研究潜在鼻咽癌患者转移的分子机制，并开发新的标志物以预测原发性鼻咽癌患者的转移风险。

表4 各组细胞侵袭细胞数及迁移率的比较

越来越多的研究显示，miRNA参与多种生物学过程，包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡、细胞周期调控以及侵袭、发育和代谢等[9]。miRNA被认为是包括鼻咽癌在内许多肿瘤的关键分子，可作为潜在的预后生物标志物[10]；在功能上，充当肿瘤抑制基因或致癌基因的miRNA的失控会影响癌症发生、发展；此外，miRNA的表达与化学抗性或放射抗性表型有关，表明miRNA在介导致癌过程中的重要性[11]。miR-454-3p是miR-454家族的一个亚基，可调控肿瘤启动、侵袭和转移机制。在神经胶质瘤、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、食管癌等恶性肿瘤中，miR-454-3p起抑癌作用，可抑制癌细胞增殖、迁移、侵袭，并促进癌细胞凋亡[12-13]。本研究发现，鼻咽癌患者血清miR-454-3p水平低于健康体检者，且Ⅲ、Ⅳ期患者组织miR-454-3p mRNA的表达水平也低于Ⅰ、Ⅱ期患者，表明miR-454-3p在鼻咽癌恶性进展中也可能发挥抑癌作用。

miRNA主要通过靶向靶基因的3'UTR，抑制其表达来发挥其功能。本研究中双荧光素酶实验结果显示，miR-454-3p可靶向ZEB2 3'UTR，降低荧光素酶活性。同时还发现，Ⅲ、Ⅳ期患者组织中ZEB2 mRNA相对表达水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者，说明了ZEB2在鼻咽癌进展中起促癌作用，与既往研究一致；且鼻咽癌组织中miR-454-3p与ZEB2 mRNA的表达呈负相关，表明miR-454-3p在鼻咽癌中的抑癌机制与ZEB2有关。ZEB家族包含ZEB1和ZEB2，可通过结合靶标E-box区充当转录抑制因子和激活因子，从而抑制一些上皮连接和极性基因（如E-cadherin），激活定义EMT表型的间充质基因（如N-cadherin），驱动EMT[14]。这也进一步提示miR-454-3p可能通过靶向ZEB2进而介导鼻咽癌EMT过程。

肿瘤转移是一个从原发部位转移到远处器官的渐进过程，包括局部浸润、内渗、弥散、外渗和定植。越来越多的证据表明，EMT是癌细胞获得转移能力的关键[15]。EMT导致细胞活动性增强，使肿瘤向远处转移部位扩散，其分子特征是上皮型标志物E-cadherin下调，间叶细胞标志物 N-cadherin、Vimentin上调[16]。EMT是由一组转录因子（EMT-TFs）介导的，其中包括ZEB家族、Snail、Twist和Slug。这些TFs通过激活或抑制维持上皮或间质特征的下游靶点来协调调控EMT，而这些EMT-TFs本身受多种信号控制，如miRNA等，EMT-TFs异常可促进肿瘤进展[17]。为进一步探究miR-454-3p对EMT的调控，笔者通过在CNE-2细胞中瞬时转染miR-454-3p mimic，结果显示过表达miR-454-3p 可显著降低 ZEB2、N-cadherin、Vimentin表达，升高E-cadherin表达，同时降低细胞侵袭及转移能力，表明miR-454-3p可抑制鼻咽癌细胞EMT。此外，为验证miR-454-3p对ZEB2的调控机制，本研究也在CNE-2细胞中转染了ZEB2过表达质粒，结果显示过表达ZEB2可逆转miR-454-3p mimic对EMT的抑制作用，促进鼻咽癌细胞侵袭、转移，与鼻咽癌组织样本结果一致，证实了ZEB2对EMT的促进作用，同时过表达ZEB2不影响miR-454-3p的表达，也进一步说明ZEB2位于miR-454-3p的下游，miR-454-3p可通过靶向ZEB2进而抑制鼻咽癌细胞EMT。

综上所述，miR-454-3p是多种恶性肿瘤的关键调控因子。本研究表明，miR-454-3p可抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移，其机制可能是靶向抑制ZEB2的表达，进而抑制鼻咽癌EMT。提示miR-454-3p可能是鼻咽癌转移风险的潜在预测指标，其在鼻咽癌转移机制中的潜在分子机制值得进一步深入探究。