中性纤维素酶促进牛粪厌氧消化性能的研究

张成明， 董保成， 李砚飞， 刘晓玲， 白耀博， 曹 丹， 刘 洁， 李十中

(1.徐州生物工程职业技术学院， 徐州市生物制药与废弃物综合利用工程中心， 江苏 徐州 221006； 2.清华大学，核能与新能源技术研究院，中美生物燃料联合研究中心， 北京 100084； 3.农业农村部农业生态与资源保护总站， 北京 100125； 4.天津大学 化工学院， 天津 300350； 5.青县新能源技术推广中心， 河北 沧州 062650； 6.中国环境科学研究院， 北京 100012)

随着大型养殖场的兴建与运营，养殖业在给社会提供了大量产品的同时，也带来一些环境污染隐患。其中，养殖粪污已经成为人们必须面对的问题。据统计，全国每年产生畜禽粪污38 亿吨。畜禽粪污价值高，但未充分利用。奶牛在我国养殖业中占有绝对优势，牛粪的合理处理也引起众多学者的兴趣，并取得很多重要成果。目前牛粪的处理方法包括厌氧消化、好氧堆肥、制作垫床、制备生物炭、养殖蚯蚓等[1-2]。各种方式均各有利弊，在特定条件下都有所应用。采用厌氧消化技术对牛粪进行处理，在回收能量的同时，还可以实现对粪污的减量化、无害化，以及高值化利用。厌氧消化结束后的沼液、沼渣通过深加工可以生产出高品质的有机肥，在获得良好经济效益的同时也可以获得良好的生态效益和社会效益[3]。

牛粪属于纤维质类原料，在其厌氧消化过程中，水解步骤是整个过程的限速步骤。为了提高纤维质原料的可生化性，在厌氧消化及纤维素乙醇领域，发展起了多种有效的原料预处理方式。常见的预处理方式包括物理法、化学法和生物法[4-6]。物理法较常用的为粉碎、汽爆、热水解、辐射等，化学法常用的为酸处理、碱处理、湿法氧化、离子液体等。常用的生物预处理方法包括真菌处理、菌群、酶处理等[7-11]。在酶处理法中，常用的酶包括纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶，以及漆酶等。李秋园[12]以木糖渣为底物，考察了纤维素酶预处理对其沼气发酵的影响。结果表明，当纤维素酶添加量为40 FPU·g-1时，试验组总固形物和挥发性固形物的利用率分别提高了19.47%和21.85%，产气量是对照组的2.34倍。王婷婷[13]等将酶(耐高温α-淀粉酶(13.4 U·g-1)、糖化酶(4.9 U·g-1)和纤维素酶(0.8 FPU·g-1)与酒糟进行混合，然后直接进行干式沼气发酵。结果表明，加酶后沼气产量增加24.7%，底物甲烷得率增加36.8%。

为了减少预处理的设备投资和节省预处理时间，结合牛粪的结构特点以及厌氧消化过程pH值中性略偏碱性的特性，本文拟采用添加中性纤维素酶来改善牛粪的厌氧消化性能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛粪取自徐州某奶牛养殖场。自然风干后，粉碎后，过20目筛保存。厌氧污泥取自彭城啤酒厂。工业级中性纤维素酶由某有限公司提供，由真菌经液体深层发酵制得，主要为内切纤维素酶，并含有较低活力的外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶组分。酶的最适温度为55℃～80℃，有效温度25℃～85℃；最适pH值6.0～7.5，有效作用pH值 4.5～9.0。酶活≥5000 FPU·mL-1。

1.2 试验方法

1.2.1 厌氧消化条件

采用甲烷潜力分析仪进行实验(AMPTS II，碧普)，反应瓶体积500 mL，装液量400 mL，产气量采用排水集气法，采用 2 mol·L-1NaOH溶液吸收CO2，获得的体积为甲烷体积。厌氧系统总固形物(Total solids, TS)为7%，接种物和底物挥发性固形物(Volatile solids, VS)比为2∶1，发酵温度35℃±2℃。根据前期预实验设计中性纤维素酶使用量。以牛粪固形物含量为基础添加，添加量分别为0，50，100，150，200 FPU·g-1TS。加入不同浓度的纤维素酶后，不进行单独的预处理实验，直接进行厌氧消化。

1.2.2 检测方法

TS，VS，氨氮，化学需氧量(Chemical oxygen demand, COD)含量测定见参考文献[14]。

2 结果与讨论

实验检测和计算牛粪厌氧消化过程中的甲烷日产气量、甲烷累积产气量以及底物甲烷得率来反映牛粪的厌氧消化性能。

2.1 中性纤维素酶对牛粪厌氧消化性能的影响

添加中性纤维素酶后，所有实验组均出现多个产气高峰，酶添加量不同，对日产气规律影响显著(见图1)。对于所有的实验组，发酵开始第1天出现产气高峰，且明显高于随后的日产气量。这是因为微生物可以快速利用牛粪中的溶出组分以及酶液中部分有机物进行产气造成的。酶添加量从0 到200 FPU·g-1时，最高日产气量分别为88.3，127.1，185.6，165.4和208.2 mL。第1高峰过后产气短暂回落，酶添加量为0，50和100 FPU·g-1试验组产气在第4～8天时分别出现第2个产气高峰，最高产气量分别为37.4，41.3和43.7 mL。随后日产气量不断减少，至发酵结束。当酶的添加达到150 FPU·g-1时，第1高峰结束后，从第2天至11天产气量较低，保持在15～25 mL。随后产气量缓慢增加，第2产气高峰出现在第22天，达到45.4 mL。当酶的添加量为200 FPU·g-1时，第1产气高峰值最高，为208.2 mL。但直到发酵23 d时，日产气量均保持在很低的水平。从第24天开始，日产气量维持在20～25 mL，直到第39天，出现一个产气相对稳定的时期。根据图1所示，当中性纤维素酶添加量超过150 FPU·g-1时，在厌氧消化过程中出了一个持续时间较长的产气高峰。这与纤维素质原料经过碱预处理的产气规律很类似[5]。数据也说明，将中性纤维素酶直接加入到厌氧消化系统中也是可行的。

图1 不同纤维素酶添加量时牛粪的日甲烷产气量

如图2所示，随着中性纤维素酶使用量的增加，甲烷总产气量逐渐增加，但是在高浓度添加酶时除了一定的产气延迟。对照组牛粪累积甲烷产量为773.1 mL，酶使用量从50 FPU·g-1增加到200 FPU·g-1时，累积产气量分别为770.3，857.6，118.4和1085.6 mL。当酶使用量100 FPU·g-1时，相应实验组出了较为明显的产气延迟。

图2 不同纤维素酶添加量时牛粪的累积甲烷产气量

2.2 中性纤维素酶对提高牛粪甲烷得率的影响

根据甲烷累计产气量以及实验中添加的牛粪质量(8 g)可以出不同实验条件下牛粪的甲烷得率(见图3)。在不考虑发酵周期的情况下，随着中性纤维素酶的添加，牛粪的甲烷得率在不断增加，分别为96.6，96.3，107.2，127.3和135.7 mL·g-1。与对照组相比分别增加0%，11%，32%和40%。数据表明，当中性纤维素酶使用量较低时，对底物甲烷得率没有影响；而随着中性纤维素酶使用量的增长，酶对底物甲烷得率的促进作用愈发明显。这从另外一个角度说，中性纤维素酶的加入可以促进牛粪的降解率。

图3 中性纤维素酶对底物甲烷得率的影响

为了评估酶使用量对甲烷产量的影响，计算得到甲烷增加量和酶使用量(底物TS质量×酶添加浓度)的比值，并以酶添加浓度为横坐标进行了作图(见图4)。

图4 单位酶对牛粪甲烷产量的贡献

如图4所示，随着酶使用量的增加，单位酶对产气的贡献也在增加，但是很快就达到了平衡。当酶添加比例为100 FPU·g-1时，酶对产气额贡献为0.11，而当酶添加浓度为150和200 FPU·g-1时，酶的功效值均为0.20。这意味着，即使进一步增加酶的使用量，酶对产气的贡献也不会再增加了。这一数据有助于在工程实践中进行经济核算。

2.3 产气现象的初步分析

本实验中，厌氧消化体系的固形物浓度较低(7%)，且底物(牛粪)为难降解性物质，因此，不会出现有机负荷过高而导致产气延迟的结果。中性纤维素酶是本实验唯一引入的外源物质，因此，产气高峰延迟的原因应该是由酶引起的。在绝大多数情况下，酶就是蛋白质，在合适的厌氧消化条件下，蛋白质会被分解为氨氮，而氨氮是常见的厌氧消化的抑制物。因此，对发酵结束后沼液中的氨氮进行了检测，以评估氨氮的抑制性。此外，对沼液的COD也进行了检测，以衡量体系中有机物的降解情况。结果如图5所示。

图5 不同中性纤维素酶添加时厌氧消化结束后沼液中的氨氮和COD浓度

如图5所示，随着酶添加量的增加厌氧消化液中的氨氮浓度也随之增加了。未添加纤维素酶时，最终体系的氨氮浓度为729 mg·L-1，当酶添加量从5 FPU·g-1增加到20 FPU·g-1时，氨氮浓度从1027 mg·L-1增加到了1835 mg·L-1。通常认为，当氨氮浓度超过1000 mg·L-1时，会对发酵产生一定的抑制。有研究表明，当氨氮浓度到达1.7～14 g·L-1时，甲烷产量减少50%。需要说明的是，氨氮对厌氧消化的抑制浓度与底物种类、微生物种群对氨氮的适应性、厌氧消化体系的TS浓度，温度，pH值等因素均有关[15-17]。现有数据表明，氨氮确实有可能会造成本实验中的产气延迟。但这仅仅是一种可能，这一结论需要深入细致的实验设计来进行证实。氨氮也是目前大规模沼气工程面临的一个现实的技术问题。对于如何实现沼液的高效、低成本脱氨，有很多学者进行了研究[18]。此外，图1中的日产气数据表明，中性纤维素酶在厌氧消化体系可以在很长时间内维持活性，而不是被很快的分解掉。王婷婷[13]等也证实，直接将酶加入到厌氧消化体系中也可以起到促进底物沼气发酵的作用。这说明，纤维素酶在厌氧消化体系中是可以长时间发挥作用的。

牛粪本身的溶解性很差，在厌氧消化结束后，消化液的COD会维持在一个较低的水平。结果表明，随着酶添加量增加，发酵结束后消化液的COD也随之增加了(见图5)，这有些出乎意料。发酵结束后，对照组的COD为1.34 g·L-1，当酶添加50 FPU·g-1和100 FPU·g-1时，COD增加不明显，分别为1.52 g·L-1和1.75 g·L-1。而随着酶添加量的增加，发酵液中COD明显增加，最高达5.69 g·L-1(200 FPU·g-1)。数据表明，当酶添加量较高时，系统中的有机物残留显著增加了。这里潜在的原因包括： 1)中性纤维素酶本身带入了一些无法被微生物分解的物质； 2)中性纤维素酶作用于牛粪使其分解，进而产生了一些难降解的物质。具体的原因需要进一步的实验来验证。

3 结论

直接向厌氧消化体系中添加中性纤维素酶可以提高牛粪的甲烷得率，这为纤维素酶的市场开拓提供了一个新的视角。本实验中酶制剂的使用量是比较高的，这应该是由于厌氧消化体系的含水量过高造成的。在实际应用中应充分考虑厌氧消化改善带来的收益与酶制剂使用带来的成本之间的平衡。中性纤维素酶在高剂量添加时会造成产气高峰的延迟，原因需要进一步分析。在后续研究中，可以考察固定化技术在该领域的应用以降低酶的成本。