紫色红掌新品种明农倾城的选育

姚凤琴，林发壮*，钟琳珊，陈昌铭，陈玮婷，林辉锋，周惠英

[1.三明市农业科学研究院， 福建 三明 365509； 2.福建省(山区)作物遗传改良与创新利用重点实验室， 福建 三明 365509； 3.古田县林业局， 福建 宁德 352200)]

红掌Anthuriumandraeanum原产于中南美洲，因具有较高的观赏价值和经济价值，现已成为全球发展较快、需求量较高的五大设施花卉之一[1]。目前，红掌已在中国大部分地区栽培种植，然而种源多为国外推广的高度杂合的商业品种，基本处于被垄断状态[2]，这对红掌产业健康可持续发展十分不利，因此积极培育推广观赏价值高，市场前景好，具有自主知识产权的优良品种，并进行国产化替代是强化红掌种业的关键所在。但我国在红掌新品种选育方面起步较晚，与国外相比还存在很大差距，目前通过自主选育的新品种还较少，已报道的仅有白马王子[3]、小娇红掌[4]、粉黛[5]、夏焰[6]、明农月华[7]等，远不能满足市场对红掌新品种多元化的需求。而且红掌由于自身缺乏飞燕草色素基因F3′5′H，无法形成深紫色和蓝色佛焰苞的红掌[8]，所以直到目前为止，紫色红掌一直是红掌育种的难题，育出的紫色红掌品种寥寥无几，目前市场上比较畅销的只有荷兰安祖公司选育推广的香妃，造成市场长期紧俏，供不应求且种源受制于人，因此迫切需要选育观赏价值高、市场前景好的紫色红掌新品种，将丰富红掌品种新型花色，弥补当前紫色红掌品种的缺乏；同时还能有效地推动我国红掌新品种选育的研发力度和推进红掌产业的良性发展。

SNP(Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，因具有数量大、二态性、稳定遗传和易于自动化检测等特点，被广泛应用于种质资源亲缘关系和遗传多样性研究[9]。红掌基因组大，且无参考基因组，而简化基因组测序(GBS，genotyping by sequencing)技术可以捕获基因组重要区域，获得大量的SNP，且无须已知基因组信息。因此通过简化基因组测序构建基于SNP标记的系统进化树来确定种质资源的亲缘关系是红掌高效育种的关键步骤。本研究通过杂交亲本的选择、人工授粉、无菌播种、单株筛选、扩繁与多点试验等，以期选育出观赏价值高、抗病性强、适应性好的紫色红掌新品种，满足消费市场对紫色红掌品种的需求，同时利用简化基因组测序技术，鉴定后代苗的亲缘关系，为红掌新品种鉴定和构建红掌指纹图谱等方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用的16份红掌材料均来自三明市农业科学研究院花卉所红掌种质资源圃，品种信息见表1。

表1 供试材料名称及来源

1.2 选育方法

红掌新品种明农倾城以Sensa为母本，该品种佛焰苞为紫色，具有杂交或自交结实率高、抗病性强、适应性好的特性；以White King为父本，该品种佛焰苞为白色，具有花粉多、抗病性强、适应性好的特性。

以观赏价值高、抗病性强、适应性好的紫色红掌新品种为育种目标，结合简化基因组的SNP标记开发及系统进化关系分析，选取性状优良的自然群体作为杂交亲本，然后进行人工授粉杂交、无菌播种、组培扩繁、出苗、单株筛选等紫色红掌新品种的选育。2014年经单株筛选，编号为12-07-11的单株入选，命名为明农倾城。

1.3 GBS测序及SNP位点分析

1.3.1文库构建流程及测序 (1)取明农倾城、其母本Sensa、其父本White King和其他13个红掌品种的嫩叶为试验材料，使用CTAB法[10]提取基因组DNA，经纯度检测，高质量的DNA用于GBS文库构建和测序[11]；(2)每个样本取250 ng，使用8 U MspI和8 U PstI HF(NEB)在30 μL反应体系37℃下双酶切反应2 h，随后在75℃下再孵育20 min，以灭活限制性酶；(3)随后取20 μL酶切产物，添加1 μL的PstI Adaptor(0.1 mol·μ-1)、1.5 μL的Common Adaptor(0.1 mol·μ-1)、200 U的T4-DNA ligase、4 μL 10×T4-DNA ligase buffer混合，总体积为40 μL在22℃下进行连接反应2 h；(4)使用0.7体积的Sera-Mag SpeedBbeads(GE Healthcare Life Sciences)对连接产物进行纯化回收，并清除小于300 bp的片段，室温下孵育5min，使用磁性支架将珠与上清液分离，并用200 μL新鲜制备的70% 乙醇洗涤3次。用40 μL 10 mol·mL-1Tris-HCl (pH 8.0)，从风干珠中洗脱DNA；(5)对每个样品进行PCR扩增，反应体系为3 μL纯化产物、16 μL H2O、5 μL 5×TaqMix(NEB)、0.5 μLPrimer1(10 mol·μ-1)和0.5 μLPrimer2(10 mol·μ-1)，首先在95℃下变性30 s，在95℃变性30 s，16个循环，引物在62℃退火20 s，片段在68℃延伸15 s，然后在68℃下最终片段延伸5 min；(6)在1.5%琼脂糖凝胶上检查8 μLPCR产物；(7)使用Qubit测定每个样品的最终难度，仅对浓度>5.0 ng·μ-1的GBS文库进行测序，对检测合格的样品取相同总量的DNA(比如30 ng)混合成库，使用步骤4对混合完的文库进行一次清理后即得到最终送测文库；(8)使用Illumina Novaseq PE150 测序平台对混合好的文库进行测序。

1.3.2SNP位点检测及差异分析 (1)使用fastqc软件对多样品混池下机Raw Reads进行质控；使用stacks软件包中的process_radtags程序，去除混池下机Raw Reads含有接头序列的Reads，并依据建库样品与barcode对应关系拆分为单样品Raw Reads。(2)使用fastx toolkit软件包中的fastx trimmer 程序，去除酶切位点序列以及 3′ 端fastqc质控质量分数小于20的所有碱基，得到Clean Reads。(3)使用Stacks[12]等软件构建参考基因组，再使用bowtie2软件将Clean Reads比对到参考基因组。(4)基于样品与参考基因组的比对结果，利用GATK软件Haplotype Caller程序生成每个样品中的GVCF文件，再通过GATK软件Genotype GVCFs程序进行群体SNP检测，对得到的群体SNP数据使用GATK软件Select Variants程序对预测结果进行筛选，得到初步SNP。(5)为了降低 SNP检测的错误率，使用VCFtools[13]软件对获得SNP分型结果进行过滤，过滤条件为Reads支持数(DP)不低于4；剔除MAF小于0.01的位点；剔除SNP分型缺失率高于20%的位点。(6)对SNP分型结果进行差异位点统计分析，位点差异筛选标准一是基于进行比较的两组去掉基因型缺失的位点，二是组内基因型一致。

1.3.3系统进化树分析 依据SNP的基因分型结果，对个体SNP标记进行首尾相连，如果缺失相应的位点，则用“-”代替。利用MEGA7.0软件采用邻接法[14](neighbor-joining method)构建进化树。通过treebest[15]软件计算距离矩阵，进化树的可靠性通过bootstrap[16]法进行检验(重复1 000次)。

1.4 品种比较试验、多点区域试验

1.4.1品种比较试验 2014-2015年对明农倾城与市场主流品种香妃进行品种比较试验。在成品花时分别随机抽取明农倾城、香妃各10盆(2株·盆-1)，测定其株高、冠幅、叶片长、叶片宽、叶柄长、叶柄直径、花梗长、花梗直径、佛焰苞长、佛焰苞宽、肉穗花序长及肉穗花序中部直径等主要观赏性状。

1.4.2多点区域试验 2016-2018年，在三明、宁德及龙岩对明农倾城进行多点区域栽培试验。在标准温室大棚中，每个试验点种植明农倾城100盆，每盆栽2株，按红掌栽培进行正常管理。同时大棚种植18个月时，每个试验点随机选取10盆，统计株高、冠幅、叶片长、叶片宽、叶柄长、叶柄直径、花梗长、花梗直径、佛焰苞长、佛焰苞宽、肉穗花序长及肉穗花序中部直径等主要观赏性状。

1.4.3数据统计与分析 试验数据采用Excel、SPSS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 选育过程

明农倾城是由Sensa与 White King人工杂交后代单株选育，选育过程见图1。2012年1月人工杂交，同年7月采收25粒成熟杂交种子，并进行无菌瓶播，种子萌发后获得18个杂交后代单株，分别对每个单株进行小量组培扩繁、出苗。2014年9月经单株筛选，编号为12-07-11的单株入选，其性状稳定，适应性好，抗寒性、抗病性强，观赏性佳，命名为明农倾城，并对其规模化繁育。2014-2015年对明农倾城与近似品种香妃进行品种比较试验，2016-2018年在三明、宁德及龙岩对明农倾城进行多点区域试验，2020年7月获得农业农村部颁发的植物新品种权证书。

图1 明农倾城选育过程Fig.1 Breeding processs of Mingnong Qingcheng

2.2 品种表现

2.2.1特征特性 明农倾城株型中等、紧凑，生长势强。从组培苗出瓶至第1朵花大约需8个月，成品花需15个月，平均株高48.84 cm、冠幅82.82 cm。嫩叶未完全展开时棕黄色(RHS比色卡152A)，完全展开时黄绿色(RHS比色卡144A)，成熟叶片深绿色(RHS比色卡NN137A)，有光泽、中等卵圆形(图2)，平均长20.21 cm，宽13.24 cm；叶柄棕绿色，平均长28.53 cm。佛焰苞高于叶，花梗直立、棕红色，平均长34.36 cm，直径4.21 mm；佛焰苞有光泽、中等卵圆形，平均长10.39 cm，宽5.84 cm，初始和观赏期为紫色(RHS比色卡N80A)，随着成熟逐渐变为浅紫色(RHS比色卡75A)，最后衰老变为粉紫色(RHS比色卡65C)(图2)；肉穗花序直立，平均长6.86 cm，中部直径8.30 mm，花粉囊即将开裂时基部和先端的主色均为深紫色(RHS比色卡79A)，随着成熟逐渐转为浅紫色(RHS比色卡77C)。1叶1花，平均花朵数6.5个，常年开花；单花寿命60～120 d，最佳观赏期30～35 d，花期持久。

图2 明农倾城叶片与花形态Fig.2 Morphology of the leaves and flowers of Mingnong Qingcheng

2.2.2品种比较试验表现 由表2、图3可知，明农倾城株高、叶柄长和花梗直径与香妃无显著差异；冠幅、叶片长、叶片宽、叶柄直径、花梗长、佛焰苞长、佛焰苞宽、肉穗花序长和肉穗花序中部直径等与香妃差异显著。另外，明农倾城嫩叶为黄绿色(RHS比色卡144A)、中等卵圆形(图3-A)，香妃嫩叶为绿色(RHS比色卡137A)、披针形(图3-B)；明农倾城的花梗长度显著比香妃的长，明农倾城的佛焰苞明显比香妃的大，且明农倾城的肉穗花序明显比香妃的长且粗(图3-C、图3-D)。

表2 明农倾城与香妃形态学特征比较

注：A为明农倾城嫩叶；B为香妃嫩叶；C为明农倾城的花；D为香妃的花图3 明农倾城与香妃嫩叶和花的形态比较Fig.3 Morphological comparison of the tender leaves and flowers between Mingnong Qingcheng and Xiangfei

2.2.3多点试验表现 由表3可知，明农倾城在3个试验点的主要观赏性状表现较稳定，其中只有株高和冠幅在宁德和三明2个试验点之间有显著差异，这可能与高海拔气候有关，同等生长周期高海拔地区红掌生长更快；其他性状差异不显著。此外，明农倾城在3个试验点的花色一致且夏季不褪色，株型中等、紧凑，生长势强，未出现明显的病虫害现象。

表3 明农倾城多点试验主要性状表现

2.2.4栽培技术要点 在温室大棚中参照福建省地方标准DB35/T 1239-2012《红掌盆花生产技术规程》进行栽培养护。选取生长健壮、刚刚展开的幼嫩叶片、叶柄为外植体进行组培快繁，待生根苗高2～3 cm、根2～3条时出瓶移植，用甲基托布津或多菌灵可湿性粉剂800倍液消毒处理后，种植于128孔穴盘，种植后立马浇透水，并用甲基托布津或多菌灵可湿性粉剂喷施1次；种植后10 d内基质保持湿润，10 d后基质保持干湿交替。待幼苗长至9 cm左右高时移至上口径9 cm 的塑料小盆中种植，每盆2株；上盆后立马浇透水，之后保持盆中基质干湿交替。待苗长至15 cm高时移至上口径13 cm 的塑料盆中种植；换盆后立马浇透水，并合理密植。营养生长阶段施用 N∶P∶K为20∶10∶20 的水溶肥，生殖生长阶段施用 N∶P∶K为10∶30∶20 的水溶性肥。

注意防治细菌性疫病、茎基腐病等病害，病害发生后应及时处理病株病叶，防止扩散。注意防治红蜘蛛、斜纹夜蛾、蚧壳虫和蓟马等虫害，可采用克螨特、吡虫啉、阿维菌素等相应杀虫剂进行防治。每种病虫害用药喷施连续使用不宜超过3次，可交替施用。

2.3 SNP位点检测及差异分析

由表4可知，明农倾城、Sensa和White King的测序序列总量为18 161 130条，总碱基数据量2.67 Gb；过滤后得到高质量总碱基数据量为2.47 Gb，平均样本数据量为0.82 Gb，碱基质量值Q20和Q30分别平均为96.52%和91.29%。经过 SNP位点检测并过滤，共获得27 969个SNP 位点。

从表5可知，比较明农倾城与其母本Sensa的SNP总差异位点有2 835个，相同位点21 591个；明农倾城与其父本White King的SNP总差异位点3 025个，相同位点22 344个；而父母本的SNP位点与子代相比，有更多的差异位点有3 794个，相同位点更少为20 618个；另外，明农倾城红掌与其母本Sensa和父本White King的SNP位点相似系数为88.39%、88.08%，表明明农倾城在SNP位点基因型上与母本Sensa亲缘关系更接近。

表4 红掌测序数据质量分析

表5 明农倾城、Sensa和 White King SNP差异位点统计

2.4 明农倾城亲缘关系分析

利用27 969个SNP标记位点通过MEGA7.0软件采用邻接法构建进化树。对16份种质资源进行聚类分析，结果表明这些种质资源被划分为3个居群，第一居群(绿色)包含9份红掌种质资源，包含Pink Champion(An107)、White Champion(An2)、Pandola(An124)、Cavalli(An139)、明农红唇(An21)、Casanova(An106)、明农霞光(An36)、Piccolo(An143)和Smprem(An99)。第二居群(红色)5份资源，包含Cherry Champion(An147)、Sensa(An80)、明农倾城(An14)、明农月华(An15)和 White King(An81)；其余2份种质资源属于第三居群(黑色) ，分别为ANTH42(An135)和Anouk(An188)(图4)。

图4 基于NJ法的红掌16个个体系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on NJ of 16 individuals of A.andraeanum

3 讨论与结论

红掌为舶来品，市场种源基本处于被国外垄断状态，只有积极选育并推广具有自主知识产权的优良新品种才能强化我国红掌种业，而目前市场上比较畅销的紫色红掌品种只有荷兰安祖公司的香妃，造成市场长期紧俏，供不应求，因此迫切需要选育紫色红掌新品种来丰富红掌花色，弥补当前紫色红掌品种的缺乏。近些年来，随着红掌育种技术的不断发展，出现了红掌诱变育种[17-18]、倍性育种[19-21]及分子育种[22-24]等研究的报道，但目前有性杂交和后代筛选仍是红掌新品种选育的最主要手段[25-26]。本试验采用常规杂交育种的方法以Sensa为母本、White King为父本杂交选育出紫色红掌新品种明农倾城。

利用GBS-seq 的SNP位点和进化树分析是鉴定品种间的亲缘关系的可靠方法。本试验对明农倾城红掌和其父母本进行SNP分子鉴定及比较分析，结果显示明农倾城的SNP位点与其母本差异点要少于与其父本的差异，同时明农倾城红掌与其父母本相同的SNP位点要多于父母之间共同的位点，明农倾城红掌与其母本Sensa和父本 White King的SNP位点相似系数为88.39%、88.08%。另外，通过进化树分析，明农倾城遗传距离更接近母本Sensa。以上证实明农倾城红掌与其父母在分子水平存在差异，明农倾城在SNP位点基因型上与母本Sensa亲缘关系也更接近。

明农倾城与主流品种香妃进行品种比较试验表明，明农倾城比香妃的花梗更长、佛焰苞更大，且明农倾城的肉穗花序显著比香妃的长且粗。经过多点区域试验表明，明农倾城在3个试验点的主要观赏性状表现较稳定，适宜于大面积推广应用，市场前景看好。