金黄色葡萄球菌菌落DNA提取方法的筛选与优化

黄雪冰，陈雅娟

(细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室/福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350108)

奶牛乳房炎是一种主要由致病微生物引起的奶牛常见病，是对全世界奶牛产业造成损失最严重的疾病[1]。引发奶牛乳房炎的致病菌主要为大肠杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌[2-3]。而由于金黄色葡萄球菌对抗生素极易产生耐药性，使得该菌引发的奶牛乳房炎治愈率很低[4]。因此，及时鉴定病原菌种类，尽快制定对应的杀菌策略，对症下药，减少耐药细菌产生，对治疗奶牛乳房炎至关重要。

常规的微生物鉴定法对分离出来的细菌分析比较单一片面，且耗时较长[5-6]，难以在畜牧业中广泛推广。目前随着分子生物学的不断发展，聚合酶链式反应(PCR)检测技术成为细菌检测的新兴手段[7]。奶牛畜牧场的微生物鉴定常常会采用16S rRNA保守序列作为分子标记来鉴定从生牛乳中分离出来的细菌种类[8-9]。但是由于金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，细胞壁较密较厚，且有荚膜等结构[5]，细菌DNA较难发生泄漏，不能像革兰氏阴性菌可以直接使用菌落或者菌液作为模板进行PCR扩增[10]，传统鉴定金黄色葡萄球菌都是提前采用溶葡球菌酶对其细胞壁进行裂解，再提取其基因组进行后续的PCR检测[11-12]。但溶葡球菌酶的价格昂贵，且提取基因组过程烦琐，至少需要2 h，如果仅是应用于微生物鉴定检测，则缺乏经济实用性。

近些年来，研究人员通过摸索探究，发现了一些物理方法或者化学方法可以代替溶葡球菌酶实现金黄色葡萄菌基因组的提取，比如CTAB法[5]、SDS法[5]、冻融法[13]、煮沸法[1]、微波法[14]和玻璃微珠法[15]等，这些方法确实节省了很多经济成本和时间成本，有很大的应用价值。但是本课题组发现，他们都是采用金黄色葡萄球菌的细菌培养液，即菌液进行PCR扩增，而菌液至少需要16 h的培养期，且也会出现金黄色葡萄球菌无法扩增出条带的情况出现[13]。

为了进一步节约时间成本，本试验拟探讨菌落能否代替菌液作为模板进行PCR扩增。首先通过煮沸法、冻融法、微波法分别处理金黄色葡萄球菌的菌液以及菌落，对比二者的PCR扩增效果；然后选取5株不同的金黄色葡萄球菌分别进行处理，测试菌落DNA提取方法的适用性；再对比不同处理时间的扩增效果，分析3种方法所需的最短时间；最终对比菌落经过3种方法处理后的上清中的DNA含量，获得更适用于PCR扩增的提取方法。本研究通过试验证明仅通过金黄色葡萄球菌的菌落也可以提取出用于PCR扩增的基因组DNA，为金黄色葡萄球菌DNA的快速提取提供新策略。

1 材料与方法

1.1 菌株

以金黄色葡萄球菌ATCC25923、Newman、RN4220、ATCC6538、MRSA为试验菌株，由本实验室保存。

1.2 试剂

胰酪胨大豆肉汤培养基TSB(北京索莱宝科技有限公司)、大豆酪蛋白琼脂培养基TSA(北京索莱宝科技有限公司)、溶葡球菌酶[生工生物工程(上海)股份有限公司]、PCR试剂PowerPol 2×PCR MIX with Dye(武汉爱博泰克生物科技有限公司)、琼脂糖(北京兰博利德生物技术有限公司)、MarkerⅡ DNA ladder(北京全式金生物技术有限公司)、核酸染料GelStain(北京全式金生物技术有限公司)、细菌基因组DNA纯化试剂盒EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(北京全式金生物技术有限公司)

1×TE缓冲液配制：1 mL体系中，980 uL高温高压灭菌双蒸水、10 uLEDTA、10 uLTris-HCl(pH=8.0)。

1×TAE缓冲液配制：1 L体系中，Tris 242 g、Na2EDTA·2H2O 37.2 g、加入57.1 mL的冰乙酸，充分搅拌；加去离子水定容至1 L后，室温保存。使用时用去离子水稀释50倍。

1.3 仪器

微波炉(广州格兰仕集团有限公司)、加热制冷型金属浴连接仪[卡尤迪生物科技(北京)有限公司]、DYY-6C电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、全自动凝胶成像系统[仪生仪世(上海)生物科技有限公司]。

1.4 试验方法

1.4.1细菌培养及样品收集 细菌培养：用灭过菌的枪头挑取少量-80℃冻存的金黄色葡萄球菌，划线于对应抗性的TSA板上，倒置于37℃恒温培养箱孵育至有明显菌落。

菌液收集：挑取单菌落于1 mL新鲜配制的TSB培养基中，培养16 h至菌液浑浊。收集上述菌液15 uL于0.2 mLPCR管中，12 000 r·min-1，60 s离心去掉上清，加入30 uL1×TE缓冲液，涡旋混匀。

菌落收集：在0.2 mLPCR管中各添加30 uL1×TE缓冲液，挑取金黄色葡萄球菌单菌落，在1×TE缓冲液中吹打，让部分菌落能落在缓冲液中，再将枪头打进含1 mL LB的试管中培养。

1.4.2DNA提取方法 DNA提取方法见表1。

表1 DNA提取方法操作步骤

1.4.3PCR扩增参数 采用NCBI上已经公布的金黄色葡萄球菌16SrRNA基因，设计基因引物为：16SrRNA-F (5′-GCGGTCGCCTCCTAAAAG-3′)，16SrRNA-R (5′-TCCCGGTCCTCTCGTACTA-3′)。

PCR反应体系：2×PCR MIX with Dye 2.5 uL，引物各0.2 uL，模板1 uL，超纯水定容至10 uL。

PCR扩增程序：95℃预变性60 s；进入PCR循环95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4.4琼脂糖凝胶电泳 称取1 g琼脂糖粉末，加入100 mL 1×TAE缓冲液，微波炉中高火加热2～3 min，直到粉末溶解，再1∶10 000加入核酸染料GelStain，凝固后在每个孔槽中加入10 uLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间为40 min。最后的结果用凝胶成像仪进行拍照保存。根据电泳图谱来判断3种金黄色葡萄球菌菌落DNA提取方法的效果，扩增条带大小为419 bp。

1.4.53种方法对金黄色葡萄球菌的菌液以及菌落DNA的提取效果比较 通过煮沸法、冻融法和微波法分别处理金黄色葡萄球菌ATCC25923的菌液以及菌落60 s，提取DNA。通过PCR扩增目的条带，琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定DNA的提取情况，比较菌液以及菌液的提取效果。以溶葡球菌酶裂解细菌提取金黄色葡萄球菌ATCC25923基因组为阳性对照。

1.4.63种方法对不同金黄色葡萄球菌的菌落DNA的提取效果测试 使用本课题组所拥有的共5株金黄色葡萄球菌(ATCC25923、Newman、RN4220、ATCC6538、MRSA)各进行3种方法的菌落DNA的提取，处理时间均为60 s，通过PCR扩增目的条带，琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定DNA的提取情况。

1.4.73种方法提取金黄色葡萄球菌的菌落DNA的时间梯度测试 控制煮沸法、冻融法和微波法的处理时间为10、20、30、40、50、60 s，分别对金黄色葡萄球菌ATCC25923的菌落进行DNA提取，通过PCR扩增目的条带，琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定DNA的提取情况。以溶葡球菌酶裂解细菌提取金黄色葡萄球菌ATCC25923基因组为阳性对照。

1.4.83种方法提取金黄色葡萄球菌菌落DNA浓度比较 挑取过夜培养的金黄色葡萄球菌ATCC25923的菌落，于30 uL 1×TE缓冲液中吹打混匀。共20个样品，分为4组，每组5个样品作为平行。其中3组样品分别通过煮沸法、冻融法和微波法进行处理，最后1组不进行处理，作为阴性对照。处理时间均为10 s，随后离心,取2.5 uL的上清进行dsDNA(双链DNA)含量的测定。

2 结果与分析

2.1 3种方法对金黄色葡萄球菌菌液以及菌落DNA的提取效果比较

由图1可知，煮沸法、冻融法和微波法均可使菌液或者菌落扩增出清晰正确的条带。虽然菌液DNA的扩增条带更加明亮，但是菌落DNA扩增出的条带已经足够单一清晰，完全满足鉴定结果的分析。

注：第1道为溶葡菌球酶提取的金黄色葡萄球菌基因组的PCR条带，2、3、4道分别为煮沸法、冻融法以及微波法提取的金黄色葡萄球菌菌液PCR条带，5、6、7道分别为煮沸法、冻融法以及微波法提取的金黄色葡萄球菌菌落PCR条带图1 3种方法提取金黄色葡萄球菌菌液及菌落DNA的PCR扩增效果Fig.1 PCR amplification effect of DNA extracted from the bacteria solution and colony of Staphylococcus aureus by the three methods

2.2 3种方法对不同金黄色葡萄球菌菌落DNA的提取效果测试

由图2可知，经过3种方法处理，不同的金黄色葡萄球菌的16S rRNA都可以被扩增出来，说明菌落DNA提取方法对于金黄色葡萄球菌具有普遍适用性。

2.3 3种方法提取金黄色葡萄球菌菌落DNA的时间梯度测试

由图3可知，煮沸法、冻融法和微波法均仅需10 s即可快速提取出金黄色葡萄球菌菌落的DNA，电泳图谱结果显示，不同时间处理提取的菌落DNA扩增条带都很准确单一，且并无时间依赖。故后续试验采用10 s作为处理时间。

注：第1道为ATCC25923提取的PCR条带，第2道为Newman提取的PCR条带，第3道为RN4220提取的PCR条，第4道为ATCC6538提取的PCR条带，第5道为MRSA提取的PCR条带图2 3种方法对不同金黄色葡萄球菌DNA的快提效果Fig.2 Effect of the three methods on the rapid extraction of DNA from different Staphylococcus aureus

注：第1-6道分别是3种不同方法处理10、20、30、40、50、60 s后PCR扩增的条带，第7道是利用溶葡菌酶提取的ATCC25923基因组PCR扩增条带图3 3种提取方法对金黄色葡萄球菌DNA时间梯度Fig.3 Time gradient of the three extraction methods on the DNA extraction from Staphylococcus aureus

2.4 3种方法提取金黄色葡萄球菌菌落DNA浓度比较

由表2可知，煮沸法、冻融法和微波法提取的金黄色葡萄球菌菌落DNA浓度的平均值分别为17.62、7.62 、6.58 ng·mL-1，冻融法和微波法提取DNA浓度较不处理组(2.86 ng·mL-1)显著提高，而煮沸法较不处理组极显著提高。

表2 3种方法提取的金黄色葡萄球菌菌落DNA浓度 (单位： ng·mL-1)Table 2 Concentration of DNA extracted from Staphylococcus aureus colony by the three methods

3 结论与讨论

奶牛养殖业中时常会爆发的奶牛乳房炎，很多时候都是因为感染了金黄色葡萄球菌，这不但会给奶牛养殖业带来巨大损失，也有可能危害消费者的身体健康。因此，快速鉴定病原菌种类，用正确的抗生素对其进行杀灭，才能避免更大的损失。

PCR技术目前已经成为各大微生物鉴定必不可少的分子技术手段，但是以金黄色葡萄球菌为代表的葡萄球菌属由于其细胞壁厚等特点，DNA的提取较为困难。目前还有许多课题组还依然在采用传统的溶葡球菌酶法提取金黄色葡萄球菌的基因组进行后续的研究。但溶葡球菌酶价格相当昂贵，操作也是较为复杂且耗时较长，对于仅需要验证的试验来说实用性不强。在近几年的探索中，陆续有研究人员发现一些方法可以代替溶葡球菌酶提取基因组，但是都是采用培养到平台期的菌液来进行试验。故本研究本着进一步减少时间成本的目的，测试了直接采取金黄色葡萄球菌菌落作为PCR模板的扩增效果。结果表明菌落中提取出的基因组DNA足够作为模板进行PCR扩增，尤其是像细菌种类检测这样不需要太高精确度的研究，菌落PCR正适合作为初步的筛选技术。本试验测试了3种处理方法，研究结果表明3种方法均能协助快速提取金黄色葡萄球菌菌落中的DNA，其中煮沸法对菌落DNA的提取效果最佳。本研究通过改进试验方法，缩短DNA提取时间，能在PCR鉴定表现出较大优势，期望本研究结果能为金黄色葡萄球菌的分子检测提供一个方法学的参考，以此协助奶牛养殖业健康发展。