木霉-植物互作生物防治机理及效应蛋白研究进展

张佳琳，李晓龙，王丽君，赵培宝

（聊城大学农学与农业工程学院，山东聊城 252000）

由于人口的激增，人类面临粮食短缺的困境，农业生产也面临巨大的挑战。如何避免过度使用化学农药对环境造成的污染、应对不良环境条件及病原体对作物造成疾病成为亟待解决的问题。开发能够自然提高植物活力的生物系统，抵御生物和非生物胁迫，从而促进它们的生长，是应对这些挑战的一个可行策略。而长期过度依赖化学农药的使用，已出现了严重的土壤、水分等生态环境问题。随着绿色农业发展战略提出及国际大环境推动，生物防治措施日益受到关注，选择对环境友好、对人畜安全、并且兼具防治病虫害的生物农药至关重要。木霉菌作为一种重要的生防菌，属于丛梗孢科的一种腐生型丝状真菌，其主要存在于森林、草地等较为潮湿的生态环境中，广泛分布于土壤、根际、叶围等环境中[1]。木霉由于其适应环境能力强，可以在各种有机和无机营养源中定殖。木霉种类有200 余种，常见的木霉有绿色木霉菌、哈茨木霉菌、深绿木霉菌、里氏木霉菌和长枝木霉菌等。在病害防治方面，木霉对病原真菌和细菌的抑制作用主要通过竞争、诱导抗性、重寄生、抗生作用来实现。木霉的竞争作用是通过在适宜环境中迅速繁殖实现对植物根系形成保护，利用其自身强大的空间利用能力和营养吸收能力来破坏病原菌对植物的侵染。诱导抗性作用是木霉菌以病原菌相关分子模式（MAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）激活免疫反应，实现木霉菌诱导植物抗性。重寄生作用是指病原菌被木霉菌识别、接触、穿透后实现对病原菌菌丝的溶解。抗生作用是通过木霉菌与病原菌互作过程中产生的乙烯、氢氰酸等挥发性代谢产物及抗菌肽等非挥发性次生代谢产物来抑制病原菌生长，且通过改变次生代谢产物及其功能基因可提高木霉菌抗胁迫作用[2]。

随着对木霉生防机制研究的深入，木霉的生防作用不仅存在于木霉与病原菌之间，同时也存在于木霉与植物之间。木霉与植物互作存在很多的过程，例如木霉与植物之间的互相识别、两者之间的激素信号的传递、诱导植物系统抗性的激活等[3]。本文通过对木霉与植物互作生物防治机理及木霉与植物互作过程木霉产生的效应蛋白参与免疫防御反应方面进行综述，以期明确木霉在与植物互作过程中的作用机理，提高木霉菌的生物防治效果及在农业生产方面的应用潜力。

1 木霉与植物互作生物防治机理

植物依靠自身各种重要的生理生化过程来适应不同生态环境条件。目前植物受到许多严酷的环境胁迫及各种寄生病原物的攻击，如病毒、细菌或真菌，这往往导致植物生长迟缓或产生疾病。为了适应生存环境的改变，通过长期的共同进化，植物已产生许多策略来对付它们的敌人。为了防止病原微生物的入侵，利用了固有的两层免疫系统，即基于PAMP/MAMPs 诱导初级防御触发免疫（PTI）来感知对抗入侵微生物和第二道防御效应器触发免疫（ETI）感知微生物的效应因子，从而快速增强寄主防御反应[4]。通过识别病原体衍生的信号分子MAMPs 或DAMPs，可以实现对外部病原体的早期识别，激活免疫反应。木霉菌通过产生分泌蛋白、次生代谢物、细胞壁降解酶等作为效应子，通过分别增强MAMPs/DAMPs 分子和效应子激发的两种免疫反应、减弱效应子引起的感病反应这三种途径实现木霉菌诱导植物抗性。寄主植物所产生的复杂的先天免疫系统在许多生态系统抵御破坏性病原体的反应机制中已经得到证实。为了抵制入侵者，植物进化出系统获得性抗性（SAR）和诱导系统抗性（ISR），通过激活水杨酸和茉莉酸的产生来触发植物的防御反应[5]。尽管SAR 和ISR 通过不同的生理激素途径发挥不同的作用，但有研究表明这些不同类型激素之间存在重叠功能。通过介导致病相关基因非表达者信号传导的免疫系统，激活分子机制复合体对远端病原微生物的系统抗性。

有益微生物是指能够刺激共生宿主植物的生长发育，促进水和营养物质的吸收，增强对病原体的免疫力。常见有益微生物包括植物促生长根瘤菌和植物促生长真菌，通常生活在根表面的根际或是寄生植物的内生菌。现有研究表明，木霉菌是一种常见的有益微生物，通过菌丝表面分泌疏水蛋白来识别植物根部表皮细胞，以附着胞形式实现菌丝附着，进而菌丝渗透到植物表皮内部，并分泌纤维素酶降解细胞壁，在定殖过程会受到水杨酸调控[6]。同时作为土壤中的一种促生菌，木霉菌可在根际生长繁殖后促进植物生长发育、提高产量。

2 木霉与植物互作过程产生的效应蛋白

2.1 半胱氨酸蛋白

半胱氨酸蛋白具有LysM 重复序列，是木霉中分泌蛋白最丰富的一种蛋白，对应于4 个及以上半胱氨酸残基。几丁质是真菌细胞壁的主要成分，在植物识别病原体激活宿主免疫反应起到重要的作用，几丁质酶参与植物病原真菌细胞壁中几丁质的催化分解，释放具有生长素运输抑制剂等有丝分裂和形态形成作用的寡糖[7]。LysM 效应子不仅可以保护真菌菌丝，干扰植物传递几丁质酶的活性，还能通过阻止真菌细胞壁产生的几丁质片段，避免免疫反应的发生。现有研究表明，黄分枝杆菌含有LysM 结构域的效应蛋白Ecp6，通过扰乱几丁质触发的宿主免疫来介导毒力，在感染植物过程中，Ecp6通过隔离入侵菌丝细胞壁释放的几丁质寡糖来防止宿主免疫。Romero 等人研究表明，深绿木霉产生LysM 蛋白Tal6，能够与复合几丁质结合，保护菌丝免受几丁质酶的侵害，增加真菌寄生能力，并调节植物防御系统的激活[8]。

2.2 cerato platanins蛋白

cerato platanins蛋白是一种非催化分泌蛋白，能够削弱细胞壁纤维素聚集体。CP蛋白家族通过保守的氨基酸残基与几丁质等低聚物结合，识别潜在病原体分子模式，诱导免疫防御反应。大部分的CP 蛋白都是在真菌细胞壁中分泌和定位的，这类蛋白在真菌和宿主植物的相互作用中发挥积极作用。绿色木霉、深绿木霉与植物互作分别产生小蛋白sm1/sm2/sm3 和诱导植物应答Epl1/Epl2/Epl3。Cheng 等研究发现，sm1/Epl1 可以作为微生物或微生物相关分子模式刺激植物免疫反应，sm1/Epl1 蛋白的单体在玉米中可以诱导植物防御反应，二聚体可以阻断ISR 激活；与sm1/Epl1相比，Sm2/Epl2 蛋白在玉米根系定植中作用更加明显[9]。Azzagli 等人研究表明，绿色木霉在植物根系定殖过程中，sm1 表达增强，在sm1 浸入玉米和棉花叶片，有助于防治炭疽病，激活植物免疫系统[10]。

2.3 疏水蛋白

疏水蛋白是一种分泌蛋白质，只存在于真菌中，由8 个保守的半胱氨酸残基构成，其表面活性较高，具有高度疏水性。疏水蛋白位于菌丝和分生孢子细胞壁的外表面，参与了木霉菌菌丝与植物根系的附着，介导真菌与环境之间的相互作用，以及在真菌与寄生虫相互作用中形成附着胞。在绿色木霉中发现关于编码疏水蛋白的基因，在木霉与植物互作过程中发挥作用。Huang 等研究表明，施用纯化的重组疏水蛋白于杨树幼苗，可以激活茉莉酸和水杨酸信号转导途径，说明疏水蛋白参与促进杨树植物的生长和防御[11]。Ruocco 等人研究发现，敲除长枝木霉中疏水蛋白HYTLO1，其拮抗活性和促进植物的生长能力下降，说明该蛋白可以激活防御反应促进植物生长发育[12]。

2.4 糖基水解酶

糖基水解酶是一类以内切或外切方式水解糖苷键的酶，参与生物体糖的合成与水解，存在于大部分的生物体中。研究证实在木霉与植物互作过程中能够产生这类蛋白质，Saravanakumar 等人通过在玉米叶片上施用哈茨木霉Thph1 和Thph2 两种酶后，导致游离胞浆钙含量的提高及活性氧的产生[13]。通过构建Thph1和Thph2 哈茨木霉缺失突变体，使得玉米中茉莉酸和乙烯信号通路相关基因的表达受到抑制。在酵母双杂交系统中，Thph1和Thph2分别与植物的自噬相关蛋白和发芽样蛋白结合，这种分子相互识别作用为分析这些靶标的细胞定位和参与诱导系统抗性提供了可能。

2.5 金属蛋白酶

这类蛋白通过保留一定量的金属离子来保持酶的活性，常见的金属蛋白酶有胰蛋白酶、中性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等。这类蛋白是关于致病真菌组织降解相关的蛋白水解酶，Tvmp1 基因是金属蛋白酶家族的主要成员之一，Khang 等人研究表明在深绿色木霉两种真菌与拟南芥接触前期Tvmp1 基因表达上调，但在接触和生长发育阶段不进行表达，说明该基因可能在木霉与植物互作早期诱导植物抗性发挥作用[14]。同样，Jia 等人在水稻稻瘟菌中发现Avr-Pita 蛋白与曲霉菌和青霉菌的金属蛋白酶具有同源性，可以诱导水稻产生抗性，也证明在诱导植物抗性中发挥作用[15]。

2.6 具有CFEM结构域的蛋白质

作为木霉属中分泌较丰富的一类蛋白质，常见于真菌细胞外膜上。这类蛋白常作为信号转导器或宿主病原体相互作用中的粘附分子或细胞表面受体来发挥作用[16]。通过生物信息学分析发现，在绿色木霉和深绿木霉中含有一些CFEM 结构的蛋白，参与和植物互作的过程中，但并非所有CFEM 蛋白都能作为植物防御的调节因子。tacfem1 是CFEM 家族成员蛋白之一，Reithner等人研究表明，该基因在与番茄红素AG-4和辣椒红素的对抗试验中可以诱导植物抗性[17]。稻瘟病菌中的Pth11 蛋白参与附着孢子的形成，在寄主定殖中发挥作用，这表明tacfem1可能在植物和真菌的寄主定殖中发挥作用。

2.7 丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶种类丰富，它的酶催化活性位点上包含丝氨酸，通过断裂大分子蛋白质中的肽键使之成为小分子，参与真菌代谢和附着胞形成[18]。丝氨酸蛋白酶家族的tvsep1 在木霉与植物接触时和接触之前表达上调，tvsep3 仅在接触时表达上调。由于丝氨酸蛋白酶能够降解肽键中的水解活性，tvsep1 和tvsep3 可能参与保护木霉菌菌丝免受宿主催化酶的侵害。Pozo等研究发现，用过表达丝氨酸蛋白酶的绿色木霉感染棉花幼苗，棉花幼苗表现出较少的病症，表明其可能在诱导植物抗性中发挥作用[19]。

2.8 硫氧还蛋白

硫氧还蛋白是植物与真菌互作过程中产生的效应物和抗氧化剂，是一种NADPH 依赖的二聚体硒酶，通过半胱氨酸-巯基-二硫化物交换促进其他蛋白质的还原[20]。其家族中有2 种重要的硫氧还蛋白：硫氧还蛋白1（Trx1）和硫氧还蛋白2（Trx2）。由于硫氧还蛋白能够直接与凋亡信号调节激酶1-ask1 结合，从而抑制导致凋亡的应激信号激活。研究表明，深绿木霉与拟南芥互作过程中，Trx2 表达上调，说明这种蛋白可能参与共生关系的建立，诱导植物的抗性[21]。

3 小结

目前，木霉是应用最为广泛的生物防治真菌之一，不仅可以直接抑制病原菌的生长，还可以通过诱导植物系统抗性来应对病虫害的威胁。此外，木霉的使用大大减少了化学农药对环境的危害。关于木霉与植物互作机理的研究是热点，植物系统抗性的产生与木霉产生的许多物质有关，通过了解木霉与植物的互作过程可以更加清楚木霉的生物防治机理，提高木霉生物防治的效果。现关于木霉与植物互作相关效应蛋白的研究较少，对接种木霉后植物转录组、蛋白组的改变的报道也比较少，而且研究的植物也比较受限制，大部分是在木霉与拟南芥、水稻、番茄及玉米等植物上，对于园林观赏植物的应用较少。随着分子生物技术的发展，关于木霉与植物互作产生的效应子研究将不断增多，对这一过程产生的分泌蛋白功能将进一步明确，这将有利于明确木霉与植物互作过程中信号传递，从而探明木霉与植物互作的机理，为木霉的高效开发利用提供理论依据。