血清表面增强拉曼光谱检测在SD大鼠舌癌诊断中的应用

刘洋 孙荣 战德松 张文洁 权慧欣

舌癌是口腔癌中发病率最高的恶性肿瘤，其预后与临床分期密切相关[1-2]。舌癌的早期临床表现不典型，常被患者忽视，大部分患者就诊时已是中晚期，延误了治疗时机，预后较差。目前舌癌的诊断主要依靠组织活检及病理学检测，病理活检给患者造成了手术创伤，对于隐蔽且较小的病损容易遗漏靶组织，且有可能造成肿瘤细胞的种植和转移。因此，临床上需要一种微创而灵敏的舌癌早期诊断技术，既可以早发现诊断、又能减小手术创伤，对患者接受程度和预后效果均有很大帮助。

拉曼光谱(Raman spectrum)是入射光照射到物质上产生的一种散射光谱，光谱中的拉曼位移代表了被测物质中分子振动或转动频率，与物质的分子结构有关，几乎每种物质都有其特定的拉曼光谱[3]。表面增强激光拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectrum，SERS)技术，是利用激光与样品内部粒子(如分子、原子、电子等)相互作用后产生的特征性峰谱来鉴别样品的一门光谱技术，它具有高分辨率、高灵敏度以及无损、快速等优点[4]。表面增强激光拉曼光谱检测不受检测样品形态的限制，适于含水生物样品的检测，样品需求量小。目前，血清的表面增强拉曼光谱检测在肿瘤学诊断的研究中已被广泛应用[5-7]。

1 材料与方法

1.1 血清样本制备

通过4NQO饮水法[8]建立舌癌动物模型，选择18 只经病理诊断确诊为舌癌的SD大鼠(27 周，雄性，舌癌组)和15 只正常健康SD大鼠(27 周，雄性，对照组)，禁食水12 h后，颈椎脱位法处死，经心脏采血2～4 mL， 3 000 r/min离心10 min，提取上清液获得血清样本。按1∶1体积比加入增强表面活性的银胶溶液，4 ℃震荡10 s混合均匀，玻璃毛细管吸取待测血清至管内约2 cm长，平置于拉曼光谱仪检测平台上。

1.2 仪器和软件

共焦显微拉曼光谱仪(LabRAM HR800，HORIBA Jobin Yvon， 法国)，激发光源为波长632.8 nm的He-Ne激发光，功率20 mW，分辨率0.65 cm-1；绘图与数据处理软件(Origin 8.0， OriginLab， 美国)。拉曼光谱仪系统设置：拉曼光谱系统在测量前使用标准硅片的 520 cm-1进行定标，设置曝光时间10 s，积分4 次，扫描范围450～1 750 cm-1， 50×物镜聚焦。每个样本测试3 个点。

1.3 数据预处理

应用Origin 8.0软件对所有表面增强拉曼光谱数据进行平滑、基线校正和归一化预处理。其中平滑处理选用Savitzky-Golay 算法的3 次多项式9 点平滑。将每个样本的3点测得的表面增强拉曼光谱值取均值，以代表其拉曼光谱信号大小。

1.4 统计学分析

应用SPSS 23.0软件对数据进行主成分分析(PCA)、线性判别分析(LDA)和受试者操作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线分析。

2 结 果

2.1 表面增强拉曼光谱(SERS)的检测结果

2 组血清SERS的外形和谱峰位置基本相似，相对峰值强度略有差别。对照组各样本SERS较为一致，舌癌组各样本间SERS离散程度较大(图 1)。

图 1 2 组血清的SERS

2 组血清平均SERS比较见图 2。 2 组血清的平均表面增强拉曼光谱形状和谱峰位置基本相似，主要在a(490～630 cm-1)和 c(950～1 120 cm-1)波段内，舌癌组血清SERS的谱峰强度高于对照组，而在b(880～940 cm-1)和d(1 200～1 310 cm-1)波段内，舌癌组血清SERS的谱峰强度则低于对照组。在峰位725 cm-1和815 cm-1两处的峰强比较可见，舌癌组明显低于正常对照组。

图 2 舌癌血清和正常血清平均SERS比较和差异图

2.2 SERS主成分(PC)分析结果

PC分析是从多个数值变量(指标)之间的相互关系入手，通过降维思路，将多个变量(指标)化为少数几个互不相关的综合变量(指标)的统计方法[9]。通常采用累计方差贡献率大于85%来确定主成分个数。对2 组血清SERS进行PC分析，共得到9 个PC，各PC得分见表 1。

表 1 2 组血清主成分(PC)得分

其中，根据累计方差贡献率大于85%，确定了两组血清的第一、 二、 三主成分(PC1、PC2、PC3)来代表两组血清的成分特征， 这三个主成分得分的方差累计贡献率为90.45%(表 2)。利用PC1、PC2、PC3得分绘制二维和三维散点图(图 3)。可以直观的看出PC1、PC2、PC3区分舌癌血清和正常血清。

表 2 各主成分特征值、方差贡献率及累积方差贡献率

图 3 2 组血清PC1、PC2和PC3得分2D和3D散点图

2.3 SERS灵敏度分析

根据第一、二、三主成分得分对2 组血清SERS进行线性判别分析，结果显示SERS对于舌癌血清的判别灵敏性为94.4%，特异性为100%，对判别效果采用交叉验证得到判别灵敏性94.4%(17/18)，特异性93.3%(14/15)，见表 3。同时，以两组血清的判别得分来构建ROC曲线，横座标为1-特异度，纵座标为灵敏度。ROC曲线下面积为： 0.996，提示判别分析结果准确性较高(图 4)。

表 3 2 组血清SERS判别分析和交叉验证结果 [n(%)]

图 4 ROC 曲线图

3 讨 论

血清学检测在癌症诊断中的应用日趋广泛[10-13]，但目前的血清学检测多使用生物化学方法，这需要肿瘤标志物在血清中达到一定浓度时才显示有效， 特异度和灵敏性较低。拉曼光谱被称为物质的“指纹性振动谱”，可以从分子水平上提供物质的结构功能信息[14]。 Králová等[15]对结直肠癌患者的血清进行了SERS检测，经主成分分析，诊断灵敏度100%，特异度94%。Lin 等[16]对鼻咽癌患者血清进行了表面增强拉曼光谱检测，经多元统计学分析，得到判别灵敏度为89.3%，特异性为71.4%。Chen 等[17]采用表面增强拉曼光谱技术对膀胱癌患者进行血清学检查，得到判别准确率97.8%。以上临床研究均说明表面增强拉曼光谱技术对癌症患者血清和正常血清或不同阶段癌症患者间的血清均能进行有效区分，并且具有较高的判别灵敏性和特异性。

通常一条拉曼光谱所包含的物质成分信息可通过对谱峰的组成、峰位、峰宽及峰强等变化表现出来，谱峰组成及强度高低一般与样品内成分的性质与含量多少密切相关[18]。结合本实验结果，发现舌癌血清与对照血清拉曼光谱形状及谱峰位置大体上相似(图 1所示)，未发现能鉴别二者的特征峰，说明两组血清所含的成分基本相似。对本研究中测得的SERS谱峰进行归属指认发现，这些特征峰主要来自蛋白质、多肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、碱基和维生素中各种化学键不同振动和转动模式，包括伸缩振动、弯曲振动、环振动、对称伸缩和α-螺旋[19-22]。癌症组血清SERS较为离散，可能是由于其样本来自于癌变的不同阶段，血清中物质含量有所差别所致；而对照组均为正常血清样本，血清中各成分较为稳定，因此对照组SERS比较一致。通过对两组血清表面增强拉曼光谱的均值比较发现，舌癌血清和正常血清的表面增强拉曼光谱的外形和谱峰位置虽基本相似，但在大约490～630 cm-1和 950～1 120 cm-1波段内，舌癌组血清表面增强拉曼光谱的谱峰强度高于对照组，而在880～940 cm-1和1 200～1 310 cm-1波段内，舌癌组血清表面增强拉曼光谱的谱峰强度则低于对照组(图 2)。 其中725 cm-1和815 cm-1波段分别是由腺嘌呤、辅酶A的C-H键弯曲振动和L-丝氨酸、谷胱甘肽的C-C-O键伸缩振动产生[21]，这两处谱峰强度的比较可见，舌癌组的峰值强度明显低于正常对照组。提示两组血清虽然主要成分相似，但各成分的含量存在差异。因此，本研究进一步通过多元统计分析方法对表面增强拉曼光谱数据中的主成分分子进行判别分析。通过主成分分析方法寻找出九个能够代表两组血清SERS的全部信息的指标作为特征性成分，选取累计贡献率为90.45%的前三个主成分，绘制二维和三维散点图(图 3)，从而将两组血清特性很好的区分出来。在此基础上采用Fisher判别分析，结果显示表面增强拉曼光谱技术对于舌癌血清的判别灵敏性和特异性分别为94.4%和100%。但本研究样本量较小，为防止判别偏移，采用了交叉验证法进一步评价该技术对于舌癌血清的判别效果。经交叉验证后，得到表面增强拉曼光谱对于舌癌血清的判别灵敏性和特异性分别为94.4%和93.3%，诊断准确率为94%，判别效果较好。根据两组判别分析得分绘制ROC曲线，得到曲线下面积为0.996，同样说明了表面增强拉曼光谱技术对于舌癌血清的诊断准确性较高。

本研究表明，表面增强拉曼光谱技术可以很好的区分舌癌血清及正常血清，且具有较高的判别灵敏度和特异度，诊断准确率较高，有望成为舌癌早期诊断的重要方法，值得深入研究其临床价值并不断完善其应用技术。