Notch信号通路分子在舌鳞癌中的表达及意义

张同韩等

[摘要] 目的 明确Notch信号通路受体Notch1、Notch3及其配体Jagged1、Jagged2在舌鳞癌中的表达及其意义。方法 通过逆转录聚合酶链反应、免疫组织化学和Western blot检测74例舌癌患者的组织标本（舌癌及癌旁组织）和人舌癌Cal-27细胞株中Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2 mRNA与蛋白质的表达水平，分析其与细胞增殖及临床病理的关系。结果 舌癌、癌旁组织及Cal-27细胞株中均检测到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA和蛋白质的表达。Notch1和Notch3蛋白在舌癌中的表达率高于癌旁组织，而Jagged1和Jagged2蛋白在舌癌和癌旁组织中的表达率无明显差异。Notch1和Notch3蛋白的表达和舌癌的临床分期具有相关性。4种信号蛋白的表达与患者的年龄、性别和临床病理分级无相关性。Notch3和Jagged2的表达具有相关性。Notch1蛋白在淋巴结转移阳性病例中的表达率高于转移阴性的病例，Jagged1在转移阳性病例的表达分级高于阴性病例。结论 Notch信号通路分子在舌鳞癌中表达活跃，与舌癌的发生发展有重要的相关性。

[关键词] 口腔癌； 口腔黏膜； Notch； Jagged1； 信号转导； 舌癌

[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.021

Notch信号途径是由配体、受体以及下游的DNA结合蛋白构成的连锁信号通路；配体包括Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4等，受体包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4等[1-2]，其下游蛋白有HES1

和HES5等[3]。虽然这些配体和受体在结构上有诸多

相似之处，但作用迥异[2]。Notch信号通路可以参与

多种细胞过程[4]，其异常与各种肿瘤的发生有关[5]；

根据细胞类型和组织类型不同而具有抑瘤或者促瘤作用[6]，在同一组织不同疾病中也可能具有抑瘤或者

促瘤作用[7]。本研究拟探讨Notch1、Notch3、Jagged1

和Jagged2的mRNA与蛋白质的表达水平，并研究其与患者的临床病理特征之间的联系。

1 材料和方法

1.1 临床资料

1.1.1 病例 选取2005—2007年间在中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院诊断为舌癌并行手术治疗的74例患者采集样本；所有病例均为未经放化疗的原发病例，年龄为25～77岁，平均年龄54.5岁，男性40例，女性34例；TNM分期和病理分级见表1。

1.1.2 组织标本的收集 所有标本均为术中获取，癌旁标本取自舌癌边界以外2 cm的舌黏膜，均经病理证实。标本一部分放入-80 ℃保存，准备提取RNA和蛋白质；另一部分放入甲醛溶液中固定，石蜡包埋后采用免疫组织化学染色。

1.2 细胞株

人舌鳞状上皮癌细胞株Cal-27购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。

1.3 引物

本实验用于逆转录聚合酶链反应（reverse trans-

criptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）的引物由大连TAKARA公司合成，引物序列见表2。

1.4 实验方法

Cal-27细胞采用免疫荧光化学染色，按照常规方法操作，进行异硫氰酸荧光素（fluorescein isothio-cyanate，FITC）标记和二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）染色；临床组织样本采用免疫组织化学染色，按常规方法操作。细胞总RNA的提取按试剂盒说明书操作，RNA质量检测合格后，通

过逆转录获得的cDNA即可用于聚合酶链反应（poly-

merase chain reaction，PCR）。PCR扩增按下列程序做循环：Notch1、Jagged1、Jagged2和β-actin，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火51 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；Notch3，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，61.8 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环。上述所有反应到最后都要在72 ℃下总延伸10 min，完成后电泳。组织蛋白提取后，根据质量浓度调整上样量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），采用槽式湿转法转膜，进行Western blot。

1.5 结果判定

1.5.1 免疫组织化学染色 400倍光镜下盲法读片，细胞内有棕黄色染色者为阳性。选取10个随机的不同的视野，计数阳性细胞数Y和细胞总数T[8]，求出

每例的Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2的阳性标记指数L。L=Y/T×100%。以L值的大小进行分级，表示染色强度的强弱：0级（L=0），1级（0

1.5.2 PCR与Western blot相对表达量的测定 各样本Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2的相对表达量为Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2条带灰度值与内参照β-actin条带灰度值的比值。

1.6 统计学分析

实验重复3次，以x±s描述结果。采用SPSS 13.0软件用方差分析和卡方检验进行统计学分析，若方差不齐者采用秩和检验，若条件不满足卡方检验者采用Fisher法；检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 RT-PCR的扩增结果

2.1.1 Notch信号分子mRNA在舌癌细胞株中的表达

RT-PCR的扩增结果见图1：Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2 mRNA在Cal-27中均有表达。

2.1.2 Notch信号分子mRNA在临床组织标本中的表达 在舌癌及癌旁组织中均可检测到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA的表达（图2）。对凝胶电泳结果进行灰度分析，舌癌组织中的相对表达量较癌旁组织高，二者的差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 Western blot测定结果

在Cal-27细胞株、舌癌和癌旁组织中均检测到了Notch信号蛋白的表达，与免疫组织化学和RT-PCR的结果一致（图3、4）。

2.3 免疫组织化学分析

2.3.1 Notch信号蛋白在Cal-27细胞株中的表达 通过免疫荧光化学法检测到Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2在Cal-27细胞株中的表达见图5。细胞中Notch1、Notch3主要表达在细胞质内及细胞膜，部分表达在细胞核内；Jagged1主要表达在细胞膜，少部分弱表达于细胞质内；Jagged2主要表达在细胞质及细胞膜。

1：病例1的舌癌组织；2：病例1的癌旁组织；3：病例2的舌癌组织；4：病例2的癌旁组织。

2.3.2 Notch信号蛋白在临床组织标本中的表达 在肿瘤及癌旁组织内，Notch1大部分表达在细胞质内，偶尔表达在细胞膜和细胞核内；Notch3在细胞膜、细胞质和细胞核均有表达；Jagged1和Jagged2主要表达在细胞质和细胞膜上。在癌旁组织内，Notch1强烈和广泛地表达于基底层和棘层，而微弱和局限地表达于颗粒层和角化层（图6A）；Notch3强烈和广泛地表达于基底层和棘层（图6B）；Jagged1强烈和广泛地表达于基底层和棘层，而微弱和局限地表达于颗粒层和角化层（图6C）；Jagged2强烈和广泛地表达于基底层（图6D）。Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2在

舌癌肿瘤细胞中均有表达（图7）。

2.4 Notch1和Notch3在舌癌的表达率高于其在癌旁

组织的表达率

Notch受体和配体蛋白在舌癌及癌旁组织的表达率有所不同。Notch1在癌旁组织的表达率为36.5%（27例），而在舌癌中的表达率为56.8%（42例），明显高于癌旁组织（2=6.10，P=0.013）。Notch3在癌旁组织的表达率为47.3%（35例），在舌癌中的表达率为63.5%（47例），高于癌旁组织（2=3.94，P=0.047）。Jagged1

在癌旁组织中的表达率为90.5%（67例），在舌癌组织中的表达率为97.3%（72例），二者差异无统计学意义（2=2.96，P=0.166）。Jagged2在癌旁组织中的表达率为74.3%（55例），在癌组织中的表达率为83.8%（62例），二者差异无统计学意义（2=2.00，P=0.157）。

2.5 Notch受体和配体蛋白在舌癌的表达与临床病

理特征的相互关系

Notch信号分子的表达阳性率与舌癌患者的年龄、性别、临床分期、淋巴结转移，以及病理分级间的关系见表3。Notch1和Notch3的表达和临床分期有相关性（P<0.05），而Jagged1和Jagged2则与临床分期无相关性（P>0.05）。Notch1、Notch3、Jagged1和Jagged2与病理分级及性别无相关性（表3）。Notch3和Jagged2的表达有相关性（表4），其他的则无相关性。Notch1在有淋巴结转移病例的表达率明显高于无淋巴结转移的病例（表3）。因为只有2个病例不表达Jagged1，所以本研究分析了Jagged1表达分级（0、1和2、3）与有无淋巴结转移的病例间的关系，结果显示，Jagged1在有淋巴结转移的病例中表达分级更高（表5）。

3 讨论

细胞功能的调节、肿瘤发生相关微环境的调控均有Notch信号参与[4]。Notch信号在肿瘤发生中既可发挥抑瘤作用，也可发挥促瘤作用，这取决于细胞和组织的类型[4，9]。在本研究中，在Cal-27细胞株、舌癌和癌旁组织中均检测到Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2 mRNA的表达，且其表达水平在舌癌中高于癌旁的舌黏膜组织。Notch信号蛋白分子明显表达于肿瘤细胞，在肿瘤组织和癌旁组织的表达水平有明显的差异，微弱和局限地表达于癌旁舌黏膜组织，但广泛和强烈地表达于舌癌组织；Notch1和Notch3蛋白在舌癌中的表达率亦高于癌旁组织：以上结果提示Notch信号通路的受体和配体在舌癌中可能起着癌基因的作用。本研究结果与其他学者[9-11]的研究结果相似。Yao等[10]报道，应用γ-secretase抑制剂L-685、L-458下调Notch1的表达可抑制人舌癌Tca8113细胞系的生长，伴随着舌癌细胞的周期停滞和细胞凋亡。Panelos等[9]研究认为，Notch1在非阳光暴露处鳞状细胞癌中的表达是上调的。Hijioka等[11]研究了Notch途径的基因在细胞系（人口腔鳞癌细胞株Ca99-2、HSC-2和HSC-4）和肿瘤中的表达，发现与正常口腔组织

中这些基因的表达相比，Notch1、Notch2和Jagged1的表达水平上调，这表明Notch信号在口腔鳞癌中表达活跃。这些研究结果表明，Notch信号通路在舌鳞癌中是被激活的。

Notch信号通路参与了人类的发育过程，在此过程中它有3种作用类型：二元谱系定向、侧向抑制和边界形成[12]。人类一生中，表皮一直都不停地更新，这个过程是由表皮基底膜的干细胞完成的。由周围的角化细胞发出的Notch信号可以引起基底干细胞的分化，在干细胞簇的边界，Notch信号可刺激人体表皮分化[13]。已有研究[13]显示，富含干细胞的基底角化细胞簇比其周围的细胞表达更高水平的Notch信号分子。Notch受体、配体和通路中的其他组分在脊椎动物表皮的不同分化阶段的角化细胞均有表达[14]。Notch受体及其配体在宫颈鳞癌表达上调，提示Notch信号可能参与调控人角化细胞的增殖[15]。异常的Notch信号可以引起上皮癌变，例如鳞癌、基底细胞癌和恶性黑色素瘤[16]。Notch信号分子也可作为肿瘤干细胞标志物在口腔上皮异常增生和口腔鳞癌的发生中起重要作用[17]。Notch信号通路成员的失调引起细胞的定向发生和分化信号异常，导致了口腔鳞癌的发生[18]。Casey等[19]报道，Jagged2在整个口腔上皮细胞都有表达并且是口腔上皮细胞分化过程中Notch1激活所必须的。本研究结果中，Notch信号分子在舌黏膜基底层的表达高于其他层，而在舌鳞癌细胞的表达强烈而弥漫，这些特征可能表明Notch信号的上调阻止了舌黏膜基底层干细胞的分化。Notch信号在舌癌发生中起着致癌作用，通过调节舌鳞癌细胞的分化而参与舌癌的发生。信号分子可能对控制正常舌黏膜上皮细胞的分化有重要贡献。类似的研究[20-21]表明，在前列腺癌和宫颈癌中Notch信号的激活是依赖Jagged1的。

本研究结果表明，Notch1和Notch3表达与舌癌的临床分期具有相关性，这意味着，Notch信号通路可能与舌鳞癌的发展有相关性；Notch3和Jagged2表达有高度相关性，提示在舌鳞癌中Jagged2与Notch3可以相互作用而产生致瘤作用，但其具体机制还需要研究；在颈部淋巴结转移阳性的舌癌病例中，Notch1和Jagged1表达率高于阴性病例：这些发现支持一个模型，那就是Jagged1蛋白水平的失调在舌癌进展和转移中发挥了作用，并提示Jagged1可能是区分舌鳞癌侵袭性强与弱的参考指标[20-23]。Sahlgren等[22]已经证明，Notch信号是缺氧刺激诱导上皮间质转化（epi-thelial-mesenchymal transitions，EMT）、增加迁徙和侵袭所必需的；抑制Notch信号可以废除缺氧诱导的EMT和侵袭，与此相反，Notch活化形式可以替代缺氧诱导这些过程而诱导EMT。研究[24]显示，Notch可调控Slug阻断Notch信号，抑制体内肿瘤模型的生长和转移；Jagged1激活的Notch信号通过调控Slug抑制E-cadherin而促进EMT。Jagged1和Hey1是Notch信号通路的一个靶基因，也参与介导转化生长因子-β诱导的EMT[25]。基于上述实验的结果，笔者推测Jagged1可能通过参与调控EMT而在舌癌的侵袭和转移中发挥重要作用。

总之，Notch信号可以影响舌生理状态下的生长发育和舌癌病理情况下细胞的增殖、分化和存活。Notch信号途径参与舌癌发生的分子机制是十分复杂的，虽然目前的研究逐渐深入，但距离完全阐明仍有很长的路要走。阐明精确的信号通路途径将为应用Notch通路的相关分子作为靶点治疗舌癌提供重要依据。

[参考文献]

[1] Mohr OL. Character changes caused by mutation of an entire re-

gion of a chromosome in drosophila[J]. Genetics， 1919， 4（3）：275-

282.

[2] Artavanis-Tsakonas S， Rand MD， Lake RJ. Notch signaling： Cell

fate control and signal integration in development[J]. Science， 1999，

284（5415）：770-776.

[3] 刘媛， 王正国， 伍亚民. Hes基因在神经干细胞发育中的作用[J].

中国临床神经科学， 2010， 18（1）：92-95.

Liu Yuan， Wang Zhengguo， Wu Yamin. Effect of Hes gene in the

development of neural stem cells[J]. Chin J Clin Neurosci， 2010，

18（1）：92-95.

[4] Leong KG， Karsan A. Recent insights into the role of Notch sig-

naling in tumorigenesis[J]. Blood， 2006， 107（6）：2223-2233.

[5] Allenspach EJ， Maillard I， Aster JC， et al. Notch signaling in can-

cer[J]. Cancer Biol Ther， 2002， 1（5）：466-476.

[6] Duan L， Yao J， Wu X， et al. Growth suppression induced by Notch1

activation involves Wnt-beta-catenin down-regulation in human

tongue carcinoma cells[J]. Biol Cell， 2006， 98（8）：479-490.

[7] Klinakis A， Lobry C， Abdel-Wahab O， et al. A novel tumour-

suppressor function for the Notch pathway in myeloid leukaemia

[J]. Nature， 2011， 473（7346）：230-233.

[8] 李蕙君， 路晓薇， 李春阳， 等. 口腔鳞癌和癌前病变中微小染色

体维持蛋白7和细胞分裂周期蛋白6的表达研究[J]. 中华口腔医

学研究杂志： 电子版， 2010， 4（3）：224-231.

Li Huijun， Lu Xiaowei， Li Chunyang， et al. Expression of mini-

chromosome maintenance protein 7 and cell division cycle protein 6

and its significance in oral squamous cell carcinoma and precan-

cerous lesion[J]. Chin J Stomatol Res： Electronic Edition， 2010，

4（3）：224-231.

[9] Panelos J， Tarantini F， Paglierani M， et al. Photoexposition dis-

criminates Notch 1 expression in human cutaneous squamous cell

carcinoma[J]. Mod Pathol， 2008， 21（3）：316-325.

[10] Yao J， Duan L， Fan M， et al. Gamma-secretase inhibitors exerts

antitumor activity via down-regulation of Notch and nuclear factor

kappa B in human tongue carcinoma cells[J]. Oral Dis， 2007， 13

（6）：555-563.

[11] Hijioka H， Setoguchi T， Miyawaki A， et al. Upregulation of Notch

pathway molecules in oral squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol，

2010， 36（4）：817-822.

[12] Bray S. Notch signalling in Drosophila： Three ways to use a path-

way[J]. Semin Cell Dev Biol， 1998， 9（6）：591-597.

[13] Lowell S， Jones P， Le Roux I， et al. Stimulation of human epider-

mal differentiation by delta-notch signalling at the boundaries of

stem-cell clusters[J]. Curr Biol， 2000， 10（9）：491-500.

[14] Watt FM， Estrach S， Ambler CA. Epidermal Notch signalling： Dif-

ferentiation， cancer and adhesion[J]. Curr Opin Cell Biol， 2008， 20

（2）：171-179.

[15] Gray GE， Mann RS， Mitsiadis E， et al. Human ligands of the Notch

receptor[J]. Am J Pathol， 1999， 154（3）：785-794.

[16] Okuyama R， Tagami H， Aiba S. Notch signaling： Its role in epi-

dermal homeostasis and in the pathogenesis of skin diseases[J]. J

Dermatol Sci， 2008， 49（3）：187-194.

[17] Takeda T， Sugihara K， Hirayama Y， et al. Immunohistological eva-

luation of Ki-67， p63， CK19 and p53 expression in oral epithelial

dysplasias[J]. J Oral Pathol Med， 2006， 35（6）：369-375.

[18] Snijders AM， Schmidt BL， Fridlyand J， et al. Rare amplicons im-

plicate frequent deregulation of cell fate specification pathways in

oral squamous cell carcinoma[J]. Oncogene， 2005， 24（26）：4232-

4242.

[19] Casey LM， Lan Y， Cho ES， et al. Jag2-Notch1 signaling regulates

oral epithelial differentiation and palate development[J]. Dev Dyn，

2006， 235（7）：1830-1844.

[20] Santagata S， Demichelis F， Riva A， et al. JAGGED1 expression is

associated with prostate cancer metastasis and recurrence[J]. Can-

cer Res， 2004， 64（19）：6854-6857.

[21] Veeraraghavalu K， Pett M， Kumar RV， et al. Papillomavirus-me-

diated neoplastic progression is associated with reciprocal changes

in JAGGED1 and manic fringe expression linked to notch activa-

tion[J]. J Virol， 2004， 78（16）：8687-8700.

[22] Sahlgren C， Gustafsson MV， Jin S， et al. Notch signaling mediates

hypoxia-induced tumor cell migration and invasion[J]. Proc Natl

Acad Sci U S A， 2008， 105（17）：6392-6397.

[23] Joo YH， Jung CK， Kim MS， et al. Relationship between vascular

endothelial growth factor and Notch1 expression and lymphatic me-

tastasis in tongue cancer[J]. Otolaryngol Head Neck Surg， 2009，

140（4）：512-518.

[24] Leong KG， Niessen K， Kulic I， et al. Jagged1-mediated Notch ac-

tivation induces epithelial-to-mesenchymal transition through Slug-

induced repression of E-cadherin[J]. J Exp Med， 2007， 204（12）：

2935-2948.

[25] Zavadil J， Cermak L， Soto-Nieves N， et al. Integration of TGF-

beta/Smad and Jagged1/Notch signalling in epithelial-to-mesen-

chymal transition[J]. EMBO J， 2004， 23（5）：1155-1165.

（本文编辑 吴爱华）