蒙药吉祥安坤丸对未成年雌性大鼠生殖发育及卵巢、子宫雌激素受体的影响

包春霞，富玉兰，何乌云嘎，王秀兰，奥·乌力吉

蒙药吉祥安坤丸是蒙医临床上治疗妇科疾病的首选药物，由益母草、赤瓟子、木香、土木香、丁香、红花等18味药物配伍组成，具有调经活血，补气安神之功效[1]。吉祥安坤丸在临床上主要用于月经不调、痛经、绝经综合征、异常子宫出血及乳腺增生等疾病的治疗，且疗效显著。目前，对于吉祥安坤丸的研究主要围绕临床应用方面，药理研究甚少。本实验以未成年雌性大鼠为研究对象，给予不同剂量的吉祥安坤丸灌胃，对其传统功效进行研究，为该药在临床上精确应用提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级未成年雌性SD大鼠36只，25日龄，体质量70～80 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司(辽宁省实验动物资源中心)，实验动物许可证号：SCXK(辽)2020-0001。饲养于内蒙古民族大学SPF级动物房，温度22～24 ℃，湿度50%～60%，适应性饲养3 d无异常的大鼠纳入实验。本实验符合相关伦理学要求。

1.2实验试剂与仪器 吉祥安坤丸(内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室，批号：内药制字14060899)；卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(PROG)、睾酮(T)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附试验试剂盒均购自江苏晶美生物科技有限公司；雌激素受体(ER)免疫组织化学试剂盒购自中国Affinity公司；95%乙醇和甲醛溶液均购自天津市大茂化学试剂厂；Cole氏苏木素染色液购自北京索莱宝科技有限公司；署红Y购自国药集团化学试剂有限公司；NIKON Eclipes显微镜购自上海土森视觉科技有限公司；eppendorf离心机购自广州吉源生物科技有限公司；TECAN SPARK多功能酶标仪购自上海闪谱生物科技发展有限公司；DP73显微镜拍照系统购自日本OLYMPUS公司。

1.3动物分组与给药 将未成年雌性SD大鼠随机分为低、高剂量组和对照组，每组12只。低、高剂量组分别给予1.0、2.0 g/(kg·d)吉祥安坤丸混悬液灌胃，对照组给予等体积蒸馏水灌胃，3组均连续给药21 d。

1.4观察指标及方法

1.4.1体质量及脏器系数：各组大鼠每4天称量体质量，给药21 d后，采用阴道细胞涂片观察发情周期，选择动情间期处理大鼠，称量体质量。每组随机选取8只大鼠按1～8的顺序编号，麻醉后腹主动脉取血，室温放置30 min后，以3000 r/min离心10 min，收集上清液，于-80 ℃冷冻保存。采血后取大鼠卵巢和子宫，生理盐水洗净，滤纸吸干，称量卵巢和子宫湿质量，然后用4%甲醛固定。计算其脏器系数，脏器系数(%)=脏器湿质量(g)/体质量(g)×100%。

1.4.2发情周期阴道细胞涂片观察：各组大鼠给药最后10 d每天8：00～8：30做阴道涂片，暴露阴道后，用蘸有少许生理盐水的无菌小棉签，缓慢置于大鼠阴道内，轻轻旋转，然后将蘸取的阴道细胞均匀涂在载玻片上，待涂片稍干后，用95%乙醇固定，HE染色后光学显微镜下观察，连续观察2个发情周期。发情周期4～5 d为正常，<4 d或>5 d均为发情周期紊乱，<4 d为发情周期缩短，>5 d为发情周期延长[2]。发情周期紊乱率=每组发情周期紊乱大鼠只数/每组大鼠总只数×100%。

1.4.3血清性激素及细胞因子测定：采用酶联免疫吸附试验检测血清FSH、LH、E2、PROG、T、IGF-Ⅰ、VEGF、TNF-α及IL-6水平。操作严格按照试剂盒说明书进行，使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度。

1.4.4卵巢和子宫组织ER的表达：采用免疫组织化学法检测。称量卵巢、子宫质量，用质量分数为40 g/L的甲醛固定，常规制片，厚约50 μm，进行免疫组织化学染色程序后封片，运用Image J软件进行定量分析卵巢和子宫组织ER的表达情况。平均光密度(AOD)=累积光密度(IOD)/面积。

2 结果

2.1吉祥安坤丸对体质量及卵巢、子宫系数的影响 3组体质量和卵巢系数比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，低剂量组子宫系数下降，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，而高剂量组子宫系数明显上升(P<0.05)。表明未成年雌性大鼠子宫可能为吉祥安坤丸的靶器官。见图1。

图1 不同剂量吉祥安坤丸处理未成年雌性SD大鼠3组体质量及卵巢、子宫系数比较

2.2吉祥安坤丸对发情周期的影响 通过观察阴道细胞涂片判断大鼠发情周期，动情前期以有核上皮细胞为主；动情期以角化上皮细胞为主，呈“落叶状”堆积或相互连接成片；动情后期以角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞为主，3种细胞数量差异不大；动情间期以白细胞为主[3]。见图2。对照组发情周期延长7只、未发情1只，发情周期紊乱率为100.0%；低剂量组发情周期延长1只、正常7只，发情周期紊乱率为12.5%；高剂量组发情周期延长4只、正常4只，发情周期紊乱率为50.0%；与对照组比较，低、高剂量组发情周期紊乱率明显下降(P<0.05，P<0.01)，但低、高剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。表明吉祥安坤丸能改善发情周期。

图2 未成年雌性SD大鼠发情各期的阴道细胞涂片(HE ×40)

2.3吉祥安坤丸对血清性激素的影响 3组血清FSH和T水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，高剂量组血清LH、E2、PROG水平均明显升高，低剂量组血清LH水平也明显升高(P<0.05，P<0.01)。表明吉祥安坤丸对卵泡的发育及排卵有一定的促进作用。见表1。

表1 不同剂量吉祥安坤丸处理未成年雌性SD大鼠3组血清性激素水平比较

2.4吉祥安坤丸对血清细胞因子的影响 与对照组比较，低、高剂量组血清TNF-α水平明显下降(P<0.05)；而VEGF、IL-6水平有上升趋势，IGF-Ⅰ水平有下降趋势，但3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。表明吉祥安坤丸可能对炎性因子具有抑制作用。见表2。

表2 不同剂量吉祥安坤丸处理未成年雌性SD大鼠3组血清细胞因子水平比较

2.5吉祥安坤丸对卵巢和子宫组织ER表达的影响 光镜下可见，ER蛋白不同程度地表达于低、高剂量组和对照组卵巢颗粒细胞和子宫组织中。见图3和4。图像分析结果显示，与对照组比较，低剂量组卵巢和子宫组织ER表达水平明显升高，高剂量组子宫组织ER表达水平明显上升(P<0.05)。表明吉祥安坤丸能促进卵巢、子宫组织中ER的表达。见表3。

图3 不同剂量吉祥安坤丸处理未成年雌性SD大鼠3组卵巢组织雌激素受体表达情况

图4 不同剂量吉祥安坤丸处理未成年雌性SD大鼠3组子宫组织雌激素受体表达情况

表3 不同剂量吉祥安坤丸处理未成年雌性SD大鼠3组卵巢和子宫组织ER表达水平比较

3 讨论

蒙药吉祥安坤丸又名乌力吉-18味丸，出自蒙医药经典著作《观者之喜》，由益母草、赤瓟子、木香、土木香等18味药物组成，方中以活血、调经的益母草和破血痞及治疗阴道疾患的赤瓟子为主药，辅以木香、土木香调和气血，佐以丁香理气、红花清血热，加以沙棘、山奈、硼砂活血化瘀、破癖，以小白蒿、刺柏叶、熊胆锁脉止血；又佐以鹿茸、冬虫夏草补益经血、强筋壮骨；以牛黄、朱砂清热镇静；以长喙诃子、五灵脂祛痹、调和体素。该方用以治疗妇女气血相搏、月经不调、腰骶关节痛、头痛、多汗、周身沉重、四肢水肿、产褥热、乳腺肿胀等诸症，故为治疗妇科疾病首选之药[4]。蒙医临床上应用广泛，疗效明确。

未成年雌性大鼠发情周期受日渐成熟的下丘脑-垂体-卵巢轴支配。生理状态下，卵巢在周期性的排卵和分泌相应性激素的同时，还伴随阴道上皮细胞周期性变化及脱落。据研究报道，大鼠发情周期中阴道脱落细胞形态结构变化主要受雌激素水平变化的影响，E2分泌不足，会造成发情周期延长和动情期缩短，故发情周期紊乱可以作为反映性激素分泌是否失衡的指标[5]。本实验结果显示，吉祥安坤丸明显升高未成年雌性大鼠血清E2水平，并改善大鼠的发情周期。该结果与吉祥安坤丸调经活血之传统功效完全吻合。

细胞因子是影响女性生殖系统生理和病理过程的重要因素。近年来，细胞因子已成为生物医学领域研究的热点。IGF-Ⅰ是由生长激素刺激肝脏产生的一类广谱性促生长因子，其生物学作用广泛，能模拟生长激素的某些生物学效应，促进细胞增殖和分化，抑制细胞凋亡，还具有类似胰岛素的代谢活性及免疫调节作用，是反映生长激素生物功能的灵敏指标[6-7]。VEGF是重要的血管形成因子和血管通透因子，由内皮细胞和子宫内膜中的巨噬细胞产生。近来研究发现，VEGF参与调节子宫内膜的生长、胚胎的发育、卵巢血管的生成及肿瘤的生长，在女性生殖功能方面起着重要的作用[8-9]。TNF-α和IL-6是机体重要的炎性因子，具有促进炎症反应及免疫调节作用，也是机体炎症反应的重要介质。有研究表明，当女性生殖器官感染时，血清TNF-α和IL-6的含量明显升高[10]。本实验结果显示，吉祥安坤丸对血清VEGF、IGF-Ⅰ水平无明显影响，但能明显降低血清TNF-α水平。一项吉祥安坤丸药理研究结果表明其具有抗炎作用[11]，而本实验明确了吉祥安坤丸具有抑制炎性因子作用。由此可见，吉祥安坤丸对女性生殖器官感染可能有一定的疗效。

人类生殖功能是机体内外各种因素综合调控的结果，而起主要调控作用的是下丘脑-垂体-性腺轴，其生理功能正常是维持女性性腺生殖功能的重要保证[12-15]。腺垂体能够分泌促性腺激素FSH和LH，FSH促进女性卵泡发育，且在LH协同作用下使卵泡分泌雌激素和孕激素，PROG通常在E2作用的基础上发挥作用，可限制子宫内膜增生，使增生期内膜转化为分泌期[16-18]。另外，女性进入青春期后，卵巢开始分泌雌激素，与靶器官的ER结合，促进阴道、子宫、输卵管及卵巢的发育，同时促使子宫内膜增生而产生月经。目前研究表明，青春期异常子宫出血原因在于性腺发育不成熟，雌激素分泌呈持续低水平，导致无排卵，致使缺乏PROG对子宫内膜增生的拮抗，使子宫内膜渐进性增生过度，导致不规律出血、崩漏[19]。本研究结果显示，吉祥安坤丸对未成年雌性大鼠血清FSH无显著影响，但能够明显升高血清LH、E2、PROG水平及子宫系数，对卵巢、子宫组织ER的表达也有一定的促进作用，故而推测吉祥安坤丸对卵泡发育及排卵有一定的促进作用，并对子宫发育也有一定的影响，其机制可能与调节子宫、卵巢组织ER有关，有待进一步研究证实。吉祥安坤丸在历代传统蒙医经典书籍中均有记载，由于其传承有别，各地区对此方药用量不同而出现临床疗效不同。本实验中，高剂量组子宫系数、血清LH、E2、PROG水平及子宫组织ER表达水平明显升高，而低剂量组只有血清LH水平及卵巢和子宫组织ER表达水平升高，而对血清E2、PROG水平无明显影响，故认为高剂量组的作用较低剂量组更优。

本实验从吉祥安坤丸对未成年雌性大鼠发情周期、性激素、细胞因子、脏器系数及卵巢和子宫ER表达的影响入手，对其药理药效进行基础研究，结果提示吉祥安坤丸能明显升高未成年雌性大鼠血清LH、E2、PROG水平及卵巢、子宫组织ER表达水平，降低血清TNF-α水平，并改善发情周期。本研究为后续吉祥安坤丸传统功效的作用机制研究，提供了一种新的思路与方法。