超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱快速分析复方守宫散化学成分及血中移行成分

梁风尘，周晋华，吴 欢，胡尚影

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；3.安徽中医药大学科研技术中心，安徽 合肥 230031)

超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight-tandem mass spectrometry,UPLC-QTOF/MS)是中药单品及复方入血成分分析鉴定工作的有力手段,具有高分辨率、高灵敏度、分析速度快等特点[1]。UPLC法已成功应用于复方守宫散中皂苷、二苯乙烯苷、蒽醌类成分的含量测定[2-4]，为复方守宫散的物质基础研究提供了一定的依据，而多级串联功能的高分辨质谱与液相色谱联用仪可为中药化学成分研究提供更有力的鉴别手段[5]。因此，为了进一步验证并鉴定复方守宫散的化学成分以及在大鼠血浆中的移行成分，本研究采用UPLC-QTOF/MS对复方守宫散原药化学成分和灌胃复方守宫散后的大鼠血浆中药物移行成分进行研究，以期为复方守宫散的质量标准制定及其临床应用提供科学依据。

复方守宫散由守宫、何首乌、梅花、生晒参、三七、没药6味中药组成，是安徽中医药大学第一附属医院肿瘤科经验方。目前，关于复方守宫散的研究主要集中于临床、药理等方面[6]，对其化学成分及血中移行成分的研究较少。本实验以UPLC作为复杂组分的分离工具，以QTOF/MS作为定性鉴别手段，通过获取目标物中各种成分离子的精确质核比，同时结合各个成分的二级质谱信息，再参考UNIFI(沃特世科学信息平台)质谱数据库和复方中单味药材已有定性分析的文献[7-9]，旨在建立一种快速高效的复方守宫散化学成分及其血中移行成分定性分析方法。

1 材料

1.1 仪器设备 沃特世超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC)、沃特世高分辨质谱仪(Waters Synapt G2-Si QTOF)、ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)：Waters；Vortex-2 Genie型台式高速离心机：Eppendorf；Vortex-2 Genie涡旋混合器：Scientific Industries；WD-9415C超声波清洗器：北京市六一仪器厂。

1.2 药品和制剂 人参皂苷Re标准品(批号 J2121165，含量20 mg)、三七皂苷R1标准品(批号 D1828145，含量20 mg)、大黄素标准品(批号 H2119124，含量20 mg)、丁香酚标准品(批号 C2130380，含量20 mg)、绿原酸标准品(批号 D2122129，含量20 mg)、槲皮素标准品(批号 J2127453，含量20 mg)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；复方守宫散(批号 20210423，含量75 g)：安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供；分析用水是超纯水，乙腈、甲醇等为色谱纯，其余试剂均是分析纯。

1.3 动物 雄性SD大鼠，SPF级，体质量(200±20)g，由安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号：SCXK(皖)2017-001]提供。动物实验经安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准，批文编号为AHUCM-rats-2021086。

2 方法

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，直径1.8 μm)；柱温：35 ℃；进样容积：10 μL；流速：0.25 mL/min；流动相：A(去离子水，含0.1%甲酸)和B(乙腈，含0.1%甲酸)，梯度洗脱(0～15 min，0%～20% B；15～50 min，20%～100% B；50～60 min，100% B；60～70 min，100%～0% B)。

2.1.2 质谱条件 质谱系统：Synapt G2-Si；质量范围：50～1 500 Da；扫描时间：0.1 s；扫描离子模式：MSE，电喷雾离子源负离子模式(ESI-)和电喷雾离子源正离子模式(ESI+)下分别采集数据；参比化合物：亮氨酸-脑啡肽(扫描时间：0.3 s；间隔时间：15 s)；毛细管电压：3 kV(ESI+)/2.5 kV(ESI-)；锥孔电压：40 V；碰撞能：10～50 eV；离子源温度：125 ℃；脱溶剂温度：500 ℃；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气流速：800 L/h；分析时间：70 min。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re、三七皂苷R1、槲皮素、大黄素和绿原酸标准品适量，分别加入二甲基亚砜溶解为1 mg/mL标准品溶液。精确称取丁香酚标准品适量，加入乙腈溶解为1 mg/mL标准品溶液。取各标准品溶液10 μL，加入1.5 mL EP管中，加入940 μL 80%甲醇水溶液[V(甲醇)∶V(水)=80∶20]，稀释为各标准品浓度为10 μg/mL的混合标准品溶液，装瓶，待测。

2.3 复方守宫散原药样品溶液的制备 取复方守宫散样品100 mg，置于15 mL离心管内，加入10 mL无水甲醇，超声30 min，取上清1 mL置于离心管中，14 000 r/min离心5 min，取上清，过0.22 μm微孔滤膜后，置入进样瓶中，用于UPLC-QTOF/MS分析。

2.4 动物实验

2.4.1 复方守宫散给药样品溶液制备 于灌胃前精密称取复方守宫散适量，加入温纯水适量，用涡旋混合器混合均匀，制成0.1 g/mL复方守宫散溶液。

2.4.2 实验动物饲养、给药、取血 将7周龄SD大鼠适应性喂养1周，饲养室温度为(25±2)℃，湿度为50%±10%，12 h人工昼夜交替，自由取食，自由饮水。第7日20:00至第8日8:00禁食12 h，期间自由饮水。禁食结束后从大鼠眼眶静脉丛采集血样1 mL，置于含肝素离心管中，3 000 r/min离心15 min，收集上清液，即空白血浆。按1.0 g/kg给大鼠灌胃复方守宫散溶液2 mL，灌胃后0.5、1、2 h，分别从眼眶静脉丛取血0.3 mL，离心，收集含药血浆，混合摇匀，置于-80 ℃冰箱贮藏，备用。

2.5 复方守宫散的血中移行成分定性分析 取含药血浆样品100 μL，置于1.5 mL EP管内，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，涡旋2 min，14 000 r/min离心5 min，取上清液100 μL，置入进样瓶中，用于UPLC-QTOF/MS分析。采用相同条件处理空白血浆样品。应用UPLC-QTOF/MS对上述样品进行定性分析，主要根据所测得化合物的相对分子量，应用UNIFI软件在规定的误差范围(±10-5Da)内计算可能的元素组成，结合各个成分色谱峰的二级质谱碎片信息等对色谱峰进行定性分析。

3 结果

在复方守宫散原药样品溶液中共鉴定出77个化学物质，包括皂苷类25个(三七皂苷6个，人参皂苷19个)、黄酮类13个、醌类12个(蒽醌类10个，萘醌类1个，含醌类1个)、糖类4个、脂酸类4个、氨基酸类3个、儿茶素类2个、芳香醇类2个、二萜类2个、挥发油类2个、其他类8个。再通过比较复方守宫散原药样品溶液、混合对照品溶液、空白血浆和含药血浆的保留时间及质谱信息，剔除在空白血浆样品中存在以及未在原药样品中发现的物质成分，最终在含药血浆中确定了27个移行成分，其中皂苷类10个(三七皂苷1个，人参皂苷9个)、黄酮类6个、醌类6个(蒽醌类5个，含醌类1个)、挥发油类2个、其他类3个。复方守宫散的化学成分及其在大鼠血浆中移行成分见表1。原药溶液、含药血浆、空白血浆、对照品溶液的TIC图见图1，典型化合物大黄素的二级质谱图及裂解规律见图2。

注：A.复方守宫散溶液TIC图(正离子模式)；B.复方守宫散溶液TIC图(负离子模式)；C.含药血浆TIC图(正离子模式)；D.含药血浆TIC图(负离子模式)；E.空白血浆TIC图(正离子模式)；F.空白血浆TIC图(负离子模式)；G.标准品TIC图(正离子模式)；H.标准品TIC图(负离子模式)

图2 大黄素的二级质谱和质谱裂解规律图

表1 复方守宫散的化学成分及其在大鼠血浆中移行成分

续表1

续表1

续表1

如表1所示，在ESI-模式下共鉴定出复方守宫散化学成分66个、大鼠血浆中移行成分24个，ESI+模式下共鉴定出复方守宫散化学成分35个、大鼠血浆中移行成分5个，其中在两种模式下均发现的有复方守宫散化学成分24个、大鼠血浆中移行成分2个。

4 讨论

复方守宫散具有补虚解毒、清肿止痛的功效，自1998年开始应用于临床以来，其疗效一直较为肯定，临床常用于治疗伴有体虚、乏力、纳差、疼痛的肿瘤患者[10-12]。

中药复方化学成分复杂，口服给药后，可吸收成分被直接吸收入血，或转化为相应代谢产物进入血液。通过血清药物化学研究可以确定中药复方中有效成分，以此为标准建立定量和定性方法，可以促进中药复方及中药制剂的质量标准化。本研究利用中药血清药物化学方法初步研究复方守宫散的血中移行成分，旨在明确其药效的物质基础，帮助建立复方守宫散质量标准的相关指标。经过测定，在复方守宫散中鉴定出77个化学成分，能够入血的成分达到27个。其中，何首乌的主要成分之一大黄素不仅能够抗肿瘤，而且可以抗菌、止咳、降血压[13]。人参有效成分20(S)-人参皂苷Rh2可使白血病患者癌细胞中HDAC1、HDAC6及HDAC2的表达水平降低，并减低其活性,最终产生遏制癌细胞增殖的效果[14]。三七皂苷R1可以通过抑制HeLa细胞的生长，改善细胞缝隙连接功能，提升顺铂的细胞毒性等，从而发挥缓解病情的作用[15]。绿原酸是梅花的化学成分之一，具有抗肿瘤和广谱的抗菌、抗病毒作用[16]。丁香酚是没药主要成分之一，不但具有明显的抗氧化作用，而且在一定浓度下对致病性真菌和金黄色葡萄球菌具有显著抑制作用[17]。这些化学成分的药理作用不仅在一定程度上对应复方中药物的功效，而且有助于从潜在的物质基础角度解释复方守宫散抗肿瘤等作用的机制。因此，结合复方中各味中药的药理学研究结果和传统功效，可以初步推断，本次实验测定的27种血中移行成分可能是复方守宫散药效物质基础的重要组成部分。

综上所述，UPLC-QTOF/MS技术不仅为复方守宫散的血中移行成分的定性分析提供了一种简便有效的分析手段，而且也为该制剂的有效成分研究及质量标准的制定提供一定参考。但是，复方守宫散的分析仍存在成分复杂、分离难度大、作用机制欠明确等问题，方中所含动物药(守宫)的血中移行成分暂时无法运用UPLC-QTOF/MS技术进行鉴定，从而限制了复方守宫散的临床推广及基础研究。