脑胶质瘤中MMP-9及vimentin蛋白表达水平与患者预后的相关性分析

刘翠萍，葛欣，贤俊民，郭西文，梁宪坤，李进军

（菏泽市立医院肿瘤科，山东 菏泽 274000）

胶质瘤是临床中常见的原发性恶性脑肿瘤，具有较强的侵袭性、致瘤性，且易出现复发，严重威胁患者的生命安全[1]。虽然肿瘤侵袭转移机制尚未完全明确，但细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）均为引起肿瘤发生侵袭、转移的关键因素[2-3]。金属基质蛋白酶可通过降解ECM促进肿瘤细胞向周围的组织侵袭转移[4]。金属基质蛋白酶-9（MMP-9）能对ECM中的IV型、V型胶原进行降解，进而参与肿瘤的侵袭与转移[5]。有研究[6]指出，波形蛋白（vimentin）对于肿瘤上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是必不可少的，会影响许多肿瘤细胞的生物学功能，尤其对肿瘤细胞的侵袭、转移发挥关键作用。本研究旨在探究脑胶质瘤中MMP-9、vimentin蛋白表达水平对患者预后的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2017 年 4 月至 2020 年 8 月本院接收的胶质瘤患者126例，随访脱落6例，实际纳入116 例作为观察组。其中女62 例，男54 例；平均年龄（48.26±4.12）岁；参照kernohan法[7]实施病理分级：Ⅰ级 30 例，Ⅱ级 37 例，Ⅲ级 28 例，Ⅳ级 21 例。另选取同期本院接收的颅脑损伤患者68 例作为对照组。其中女 47 例，男 21 例；平均年龄（49.00±5.00）岁。两组临床资料比较差异无统计学意义，具有可比性。本研究获得医院伦理委员会审核批准。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：患者均经诊断明确为胶质瘤；符合与WHO 有关的分类标准[8]；均开展显微手术切除；患者及家属均签署知情同意书；均以头痛、头昏、肢体乏力以及呕吐等颅内压上升表现为主要症状，部分患者伴随视力降低、语言障碍或偏瘫。排除标准：接受过化疗或放疗者；有脑部手术或脑部严重外伤病史者；精神或认知明显障碍，不具备正常沟通交流能力者。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学 应用10%的甲醛固定脑组织，石蜡包埋后，进行切片、脱蜡，并进行热抗原修复，通过漂洗、孵育后，滴1∶100已稀释好的MMP-9、vimentin，4 ℃过夜孵育；加二抗，37 ℃孵育30 min；加辣根酶标记工作液，37 ℃孵育30 min，出现DAB显色后，借助苏木素予复染、脱水。借助显微镜，应用Image-ProPlus 6.0 对免疫组化染色切片进行检测、观察，并评判结果。无阳性细胞为“-”；阳性细胞计数＜25%，为“+”；阳性细胞计数为25%～50%，为“++”；阳性细胞计数＞50%，为“+++”。“-”“+”为阴性，“++”“+++”为阳性。

1.3.2 反转录荧光定量PCR 利用Trizol法提取肿瘤组织mRNA，并通过逆转录合成cDNA。设计靶基因（MMP-9、vimentin）及管家基因（β-actin）的上下游引物，应用实时定量聚合酶链反应试剂盒对mRNA 进行检测，各项扩增程序：95 ℃变性15 s，62 ℃退火 25s，72 ℃延伸 35s。借助 2-ΔΔCt计算观察组脑组织中目的基因的mRNA。

1.3.3 随访观察 从患者接受显微手术切除治疗后开始随访，至2020 年8 月21 日截止，借助门诊回访、电话及微信回访等了解肿瘤是否出现复发与转移及患者的生存率。

1.4 观察指标 比较两组免疫组化检查结果、MMP-9、vimentin mRNA 表达水平差异及胶质瘤患者预后影响因素。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，计量资料以“”表示，行t检验，计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验；采用Logistics多元回归分析影响胶质瘤患者预后的相关因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检查结果 免疫组化结果表明，观察组MMP-9、vimentin 阳性率为65.5%和73.3%，对照组MMP-9、vimentin 阳性率为10.3%、17.6%，两组MMP-9、vimentin 的表达比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

表1 两组脑组织MMP-9、vimentin免疫组化结果比较Table 1 Comparision of MMP-9 and vimentin immunohistochemistry between two groups

图1 脑组织中MMP-9、vimentin的免疫组化结果Figure 1 Immunohistochemical results of MMP-9 and vimentin in brain tissue

2.2 两组MMP-9、vimentin mRNA 表达水平差异分析 观察组脑组织MMP-9 和vimentin mRNA 相对表达水平显著高于对照组（t=3.135，P＜0.001；t=2.774，P＜0.001），见图2。MMP-9和vimentin mRNA相对表达水平与胶质瘤的病例级别相关，高级别的神经胶质瘤MMP-9 和vimentin mRNA 相对表达水平高于低级别神经胶质瘤（P＜0.05），见图3～4。

图2 两组患者脑组织MMP-9和vimentin mRNA相对表达水平Figure 2 Relative mRNA expression of MMP-9 and vimentin in brain tissue of two groups patients

图3 不同级别胶质瘤患者MMP-9 mRNA的相对表达水平Figure 3 Relative mRNA expression of MMP-9 in different grades gliomas

图4 不同级别胶质瘤患者vimentin mRNA的相对表达水平Figure 4 Relative mRNA expression of vimentin in different grades gliomas

2.3 胶质瘤患者预后影响因素的Logistics 回归分析 Logistics 回归分析结果表明，MMP-9 和vimentin mRNA 表达水平均为影响胶质瘤患者预后的关键因素（P＜0.05），见表2。

表2 胶质瘤患者预后影响因素的Logistics 回归分析Table 2 Logistic regression analysis of prognostic factors in patients with glioma

2.4 MMP-9、vimentin 表达水平对患者预后的影响观察组MMP-9、vimentin 表达与其生存率存在相关性，Kaplan-Meier生存分析指出，MMP-9、vimentin的表达与胶质瘤患者的累积总生存率密切相关（P=0.0171、0.0315），当MMP-9、vimentin表达为阴性时，患者的预后更好，见图5～6。

图5 MMP-9对胶质瘤患者生存率的影响Figure 5 Effect of MMP-9 on survival of glioma patients

图6 vimentin对胶质瘤患者生存率的影响Figure 6 Effect of vimentin on survival of glioma patients

3 讨论

胶质瘤是具有较强侵袭性的恶性肿瘤，其高病死率与强侵袭性密切相关[9]。近年来，有研究[10]对肿瘤所出现的侵袭、转移等有关机制进行分析与研究，指出ECM、EMT 均与肿瘤的侵袭、转移密切相关，因此，探究ECM相关蛋白以及EMT相关蛋白处于强侵袭性恶性肿瘤中总体的表达，对于癌症的各项诊断与治疗均具有重要意义。

研究表明，MMP 家族蛋白与多种肿瘤的预后显著相关，尤其是对于高级别胶质瘤患者，肿瘤组织MMP家族蛋白的高表达对肿瘤的侵袭与转移以及患者的生存期具有重要影响[11-12]。MMP 家族蛋白可通过降解细胞外基质蛋白，激活信号转导级联反应，从而促进ECM 相关生长因子，如 TGF-β 的转移。MMP-9 是一类重要的金属基质蛋白酶，MMP-9 在星形胶质细胞以及胶质瘤细胞的生长、侵袭中具有关键作用[13]，同时，Tadas等[14]指出，在小鼠和人的神经胶质瘤组织中，MMP-9大多出现在小胶质细胞中，且对TLR2有关的信号通路激活后，能促进小胶质细胞中MMP-9总体表达。本研究结果表明，胶质瘤患者脑组织中的MMP-9 高于正常脑组织。Li等[15]应用全基因组分析的方法探究了MMP 家族各个成员，结果表明，胶质瘤组织中MMP-9、MMP-1均高于正常脑组织，与本研究结果一致。vimentin是EMT相关的经典标志分子，可通过上调Axl受体酪氨酸激酶促进EMT 的进程从而促进肿瘤细胞的转移[16]。vimentin可通过参与多种信号通路的调节而促进肿瘤发生发展，因此，vimentin很有可能成为肿瘤治疗的新靶点，目前以vimentin 为靶点的相关药物如醉茄素A、水飞蓟宾等对高表达vmentin的肿瘤均表现出良好的治疗效果。本研究中，胶质瘤中vimentin高于正常脑组织，且不同级别的胶质瘤患者vimentin表达不同，表明vimentin不仅可作为胶质瘤诊断的相关指标，而且有望成为胶质瘤治疗的靶点。

此外，本研究结果也表明，MMP-9 和vimentin的表达水平均为影响患者预后的独立相关因素，Kaplan-Meier生存分析结果也表明，高表达MMP-9和 vimentin 的胶质瘤患者预后更差，与 Li 等[15，17]研究结果一致，但Li 等[15]证明了vimentin 表达偏高会使患者对替莫唑胺产生耐药性。本研究尚未探讨MMP-9和vimentin表达是否会使患者产生耐药性，未来将进一步阐明MMP-9 和vimentin 表达是否具有相关性且是否与患者产生耐药性相关。

综上所述，胶质瘤患者MMP-9、vimentin 表达高于对照组，且MMP-9、vimentin 与胶质瘤患者的病理级别密切相关，在具有更高级别的神经胶质瘤患者脑组织中的MMP-9 和vimentin 表达水平高于低级别神经胶质瘤，且MMP-9、vimentin 表达水平是影响患者预后的独立相关因素，MMP-9和vimentin低表达的患者预后更好，为胶质瘤患者的诊断以及预后预测提供了的临床依据。