多壁碳纳米管小柱-液质联用法测定鸡肉中兽药残留方法的研究

杨 俊，丁红梅，何薛纯，施炎炎

南通市食品药品监督检验中心 (南通 226006)

鸡肉中蛋白质含量高、脂肪含量低、胆固醇低，是优质营养物质来源[1]。鸡肉深受消费者的喜爱，我国不仅是鸡肉的生产大国，也是鸡肉的消费大国。在肉鸡的饲养过程中，不可避免会使用多种兽药预防或治疗传染性疾病。兽药的应用提高了肉鸡的成活率，增加产量，促进禽类养殖的良性发展。但是在养殖环节中，由于农户缺乏兽药的使用的专业知识，容易超范围或超剂量使用兽药，导致鸡肉中喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类、四环素类等禁限兽药超标[2-6]。

鸡肉中兽药残留的前处理方法有超临界萃取法、加速溶剂萃取法、毛细管固相微萃取法、固相萃取法、分子印迹固相萃取法等[7-10]。多壁碳纳米管(MWCNTs)是一种新型的纳米碳材料，具有性质稳定、吸附能力强、易修饰和成本低廉等特点，对众多无机或有机物均具有优良的吸附性能，近年来被作为一种新型吸附材料广泛应用于多种类农药残留、兽药残留同时检测中[11-13]。

本文采用QuEChERS提取、滤过型多壁碳纳米管(MWCNTs)净化技术，同时测定鸡肉中四类兽药残留。该方法简便快速准确、灵敏度高，能满足限量要求，可为鸡肉中多种兽药残留检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇，色谱纯，德国Merck公司；无水甲酸，分析纯，上海阿拉丁；无水硫酸钠、氯化钠，分析纯，国药集团；QuickProQuEChERS-VD净化柱，河南华仁健康；0.22 μm微孔滤膜，上海安谱；恩诺沙星(1 000 μg/mL)、恩诺沙星-D5(100.3 μg/mL)、氯霉素(99.9 μg/mL)、氯霉素-D5(100 μg/mL)，上海安谱；环丙沙星(1 000.8 μg/mL)、环丙沙星-D8(100.2 μg/mL)、磺胺嘧啶(100.5 μg/mL)、磺胺甲基嘧啶(100.6 μg/mL)、磺胺二甲嘧啶(100.6 μg/mL)、磺胺间甲氧嘧啶(99.9 μg/mL)、磺胺邻二甲氧嘧啶-D3(100.3 μg/mL)、磺胺甲恶唑(100.5 μg/mL)、磺胺间二甲氧嘧啶-D6(1 004 μg/mL)、磺胺间二甲氧嘧啶(99.9 μg/mL)、磺胺喹沙啉(99.9 μg/mL)、氟苯尼考(1 000.9 μg/mL)、土霉素(93.8%)、四环素(96.3%)、金霉素(80.6%)强力霉素(92.4%)，天津阿尔塔。

1.2 仪器与设备

Vanquish/Altis型超高压液相色谱-串联质谱仪，美国赛默飞世尔公司；SECURA225D-1CN型电子天平、BSA224S型电子天平，德国赛多利斯公司；VM-2500型多管旋涡混合仪，广东安胜仪器有限公司；TGL-16M型台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Xcelvap型氮吹浓缩仪，美国Horizon公司；Milli-Q Reference型实验室超纯水仪，美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1色谱条件

色谱柱为Accucore VDX柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；柱温为30 ℃；进样量为2 μL；流动相为0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)，流速0.3 mL/min；采用梯度洗脱程序：0.0～6.0 min，95% A～5% A；6.0～8.0 min，5% A；8.0～8.1 min，5% A～95% A；8.1～10.0 min，95% A。

1.3.2质谱条件

采用电喷雾电离(ESI)扫描；喷雾电压3 500 V(ESI+)、2 500 V(ESI-)；鞘气流量4.1 L/min；辅助气流量5.1 L/min；吹扫挡锥气流量1.5 L/min；蒸发温度450 ℃；离子传输管温度200 ℃；碰撞气压0.2 Pa。检测方式为选择反应监测(SRM)。

1.3.3标准溶液的配制

分别称取固体标准物质10 mg标准物质于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，浓度为1 000 μg/mL。用移液枪分别移取适量兽残单标母液，用甲醇水(1+1)溶解，制成兽残混标工作溶液，其中四环素类浓度为10 μg/mL，其余浓度为1 μg/mL，内标浓度为1 μg/mL。

1.3.4样品前处理

准确称取鸡肉样品5 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加入200 μL内标，加入10 mL 2.5%甲酸乙腈溶液，匀浆1 min。在离心管中加入2 g无水硫酸钠和2 g氯化钠，快速振荡混合，涡旋3 min，6 000 r/min离心5 min分层，移取3 mL上层乙腈层溶液于QuickProQuEChERS-VD多壁碳纳米管净化小柱中，推动柱塞杆，控制低速1滴/s，收集滤液，45 ℃氮吹至近干，用1 mL含0.1%甲酸的乙腈+水(1+1)复溶，经0.22 μm有机微孔滤膜，滤液供液相色谱质谱联用仪测定。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的优化

在鸡肉样品中加入提取溶剂后，采用直接涡旋或超声提取的方法虽然能提取出细胞中的兽药，但是提取效率不佳、回收率低。采用匀浆提取，将成团的样品均匀分散，可以使细胞破裂，再通过超声提取，有利于目标化合物的提取。

乙腈是样品前处理常用的提取溶剂，在兽药提取上有明显的优势，并能减弱脂质干扰。在乙腈中加入少量甲酸，有助于提高喹诺酮类药物的回收率。酸度过低，磺胺类兽药在溶液中的解离程度低，并发生一定程度的降解，提取回收率偏低，本文采用2.5%的甲酸乙腈作为提取溶剂。匀浆提取后加入氯化钠促进水相和有机相分离，加入无水硫酸钠除去有机相中少量水分。

2.2 色谱条件的优化

采用Accucore VDX色谱柱对化合物进行色谱分离，在流动相中加入0.1%甲酸可以提高目标化合物的电离效率。采用梯度洗脱方式进行4类兽药的色谱分离，初始阶段5%乙腈将极性较大的杂质洗脱，然后逐渐增加乙腈比例，使目标化合物在色谱柱中分离。初始阶段的水相比例高，而样品提取溶液中为高比例的乙腈溶液，进样体积过大，有较强的溶剂效应，导致峰形分叉、拖尾等现象。考察了进样体积分别为10、5、2 μL时各化合物的峰形，当进样体积为2 μL时，能有效避免溶剂效应，有利于准确定性定量分析。15种目标化合物总离子流图见图1。

图1 15种兽残混合标准溶液和5种兽残同位素内标的总离子流图

2.3 质谱条件的优化

通过针泵将1 μg/mL标准溶液直接注入质谱中，根据各化合物的相对分子质量和带电方式，进行一级质谱的全扫描，得到分子离子峰。调整离子源电压及喷雾气压，待各化合物响应值相对标准偏差稳定在15%以下，对母离子进行二级质谱扫描，得到子离子信息，同时优化碰撞能量及RF透镜电压，选取2个响应高、基质干扰小的特征离子进行分析，15种兽残的质谱分析优化参数见表1。氯霉素、氟苯尼考采用负离子模式，其他均为正离子模式。

表1 15种兽残和5种同位素内标的质谱分析优化参数

2.4 标准曲线、线性范围和检出限

本方法采用鸡肉基质匹配外标法或内标法建立标准曲线，以目标化合物定量离子的峰面积或目标化合物定量离子与内标定量离子比值为纵坐标、相应质量浓度X为横坐标绘制标准曲线。恩诺沙星、环丙沙星、氯霉素以各自的氘代同位素作为内标，磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑以磺胺邻二甲氧嘧啶-D3作为内标，磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹沙啉以磺胺间二甲氧嘧啶-D6作为内标，基质匹配内标法定量；氟苯尼考、土霉素、四环素、金霉素、强力霉素以基质匹配外标法定量。以信噪比大于3计算方法的检出限，检测结果见表2。从表2中可以看出，15种兽药在各自的线性范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数为0.994 6～0.999 9，15种兽药的检出限在1.0～20 μg/kg之间。

表2 15种兽残的线性范围、线性方程、相关系数和检出限

2.5 回收率与精密度

在空白鸡肉样品中添加15种兽药混合标准溶液，加标含量分别为10、20、50 μg/kg，按上述前处理方法及测定条件进行回收率试验，每个添加水平做6次平行测定，结果见表3。各化合物的回收率为74.3%～118.6%，相对标准偏差为1.1%～11.3%。

表3 鸡肉空白基质中15种兽残的加标回收率和精密度(n=6)

3 结论

本文建立了液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中4类兽药残留，采用QuEChERS提取方法，经滤过型多壁碳纳米管小柱净化，建立了鸡肉样品提取、净化的前处理方法，并优化了色谱和质谱条件。该方法能同时测定多类兽药残留，缩短了检测周期，降低了有机溶剂的消耗，该方法简便快捷、可靠性好，灵敏度高，为食品检验机构提供了鸡肉中多种类兽药残留方法。