连翘精油- ε-pL-Nisin复合涂膜保鲜液配制

高 倩，张晓虎，郭元园

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

0 引言

连翘为木犀科连翘属植株，不仅具有清热解毒、降火消肿、利尿、保护心血管、抗癌等药理作用，而且具有抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化等作用[1～4]。研究表明，连翘可作为双黄连口服液、连花清瘟颗粒、维C银翘片等药剂的重要原料组成成分，也可应用于医疗保健、食品保鲜、化妆品等领域[5]。连翘精油是一种具有特殊芳香气味、分子量较小的有机代谢化合物，广泛存在于连翘植株的花、叶和果实中，尤其在果实中的含量高达4%[6,7]，主要抑菌有效成分由单萜、倍半萜烯、丙酮、醛、酚、醇等组成。连翘精油呈棕黄色液体，在常温下易挥发，具有显著的抑菌、抗菌、抗氧化、抑制微生物生长繁殖、抗病毒等生物活性[8,9]。

番茄又称为西红柿，属于茄科属植物，其作为一种呼吸跃变果实，含有丰富的番茄红素、维生素C、类胡萝卜素等多种营养物质，但是由于水分含量较高、果皮薄，因此其易受微生物的影响，抗病力弱、易软腐，导致番茄不耐储存，保鲜效果差，锁水时间短[10]。

目前，食品安全问题受到广泛关注，食品保鲜防腐剂的天然化已成为一种不可逆转的发展趋势，安全、天然、高效的食品才会备受青睐。复配型天然保鲜剂不仅高效、稳定性好，而且高度安全、价格适中。研究表明不同性能的抗菌剂的适量配合制成的防腐剂具有增效和协同作用，可以克服单一防腐剂的不足[11,12]。根据壳聚糖[13～15]、ε-聚赖氨酸[16～18]和Nisin[19,20]的抑菌作用机理及作用于微生物的方式不同，将三者与连翘精油进行复配，可达到增效协同的作用且有效扩大抑菌谱，节约生产成本。

笔者以连翘精油为原料，辅以壳聚糖、ε-聚赖氨酸、Nisin制备复合保鲜涂膜液，采用响应面法优化配方，对番茄进行保鲜实验研究，以期有效延长番茄的保鲜期，为连翘精油保鲜涂膜液在果蔬贮藏保鲜提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 连翘果实(2019年9月采于商州区金凤山)；当日产新鲜番茄(购于商州区菜市场)。

1.1.2 试剂 CO2(食品级，纯度在 99%以上，购于成都市缘和基业化工有限责任公司)；95%乙醇(分析纯)；蒸馏水；次氯酸；壳聚糖(食品级)；ε-聚赖氨酸(食品级)； Nisin(食品级)；冰乙酸(分析纯)。

1.1.3 供试菌种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌(商洛学院微生物实验室提供)。

1.1.4 仪器设备 见表1。

表1 实验主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 将连翘果实清洗干净、放置通风处干燥后，于60℃电热恒温干燥箱烘干，高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，取若干份(每份10 g)，分装后用纱布包裹，密封备用。

1.2.2 连翘精油的萃取 采用超临界CO2流体萃取连翘果实中的精油[21]。

1.2.3 连翘精油的抑菌试验 将蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g，溶解于1 000 mL蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液大约2 mL，调节pH至7.2～7.4。加入琼脂20 g继续加热煮沸，待琼脂融化后分装试管中，每管2～3 mL，经121℃高压灭菌20 min。参考文献制备菌悬液[22]，采用滤纸片法测连翘精油抑菌环直径[23]。

1.2.4 涂膜液的制备 分别称取适量的连翘精油、壳聚糖、ε-聚赖氨酸、Nisin溶于蒸馏水中配制不同浓度梯度的保鲜涂膜液，将番茄浸泡于保鲜液中处理3 min后取出，晾干；对照组放在蒸馏水中浸泡3 min，捞出晾干，分别置于一次性消毒保鲜盒中，在25℃、相对湿度65%的条件下贮藏10 d，每隔2 d取样一次，测定番茄的失重率和维生素C含量，每组重复三次，结果取平均值。

1.2.5 番茄的选择与处理 选择大小均一 、色泽及成熟程度一致、无机械损伤和害虫侵染的番茄果实，用清水充分冲洗果实表面，用浓度为2%的次氯酸溶液进行清洗消毒，最后用缓水流冲洗2 min，放置在通风处晾干，分组备用。

1.2.6 单因素试验设计 分别配置连翘精油浓度(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、壳聚糖溶液浓度(0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、ε-聚赖氨酸浓度(0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%)、Nisin浓度(0、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%)的涂膜保鲜液，按照1.2.4中的方法处理番茄。

1.2.7 番茄新鲜度指标测定 主要有:

(1)失重率采用称重法计算[24]。

失重率(%) =(储藏前的称重-储藏前后的重量)/储藏前的重量×100%

(2)Vc含量采用2,4-二硝基苯肼比色法测定[25,26]。

1.2.8 响应面实验设计 在单因素试验基础上，选择3个影响显著的因素，依据中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面分析实验，以失重率和VC含量作为响应值，实验所得数据采用Design-Expert 8.06软件进行作图和分析，确定保鲜涂膜液的最佳复合配方。

2 结果与分析

2.1 连翘精油抑菌实验

表2 不同浓度连翘精油抑菌效果

由表2可知，抑菌圈的直径愈大，其抑菌效果愈好。连翘精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌抑菌效果更显著，即对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌，并且抑菌效果均随着连翘精油组分浓度的增加，抑菌活性亦增强。

2.2 单因素实验结果与分析

由图1～图4可知，分别用不同浓度连翘精油、壳聚糖、ε-聚赖氨酸、Nisin处理番茄，随着贮藏时间的增加，其失重率呈逐渐上升趋势，维生素C含量呈缓慢下降趋势，各处理组番茄的失重率均低于对照组，维生素C含量均高于对照组；0.5%浓度的连翘精油，随着储藏时间的延长对番茄失重率和维生素C含量变化的差异不太大；0.1%浓度的ε-聚赖氨酸，随着储藏时间的延长对番茄失重率和维生素C含量变化的差异不太大；1%、1.5%、2.5%浓度的壳聚糖，随着储藏时间的延长对番茄失重率和维生素C含量变化的差异不太大；0.01%浓度的Nisin，随着储藏时间的延长对番茄失重率和维生素C含量变化的差异不大。综合考虑，最终固定壳聚糖浓度为2%，选取浓度连翘精油浓度1%～2%；ε-聚赖氨酸浓度0.3%～0.7%；Nisin浓度0.03%～0.07%。

图1 不同浓度连翘精油对番茄失重率和维生素C含量的影响

图2 不同浓度ε-聚赖氨酸对番茄失重率和维生素C含量的影响

图3 不同浓度壳聚糖对番茄失重率和维生素C含量的影响

图4 不同浓度Nisin对番茄失重率和维生素C的影响

2.3 响应面实验结果与分析

2.3.1 响应面实验方案与结果 综合考虑单因素实验结果分析，固定壳聚糖的浓度为2%，以连翘精油浓度(A)、ε-聚赖氨酸浓度(B)和Nisin浓度(C)为自变量，以失重率和Vc含量作为响应值(Y)。采用Design-Expert 8.06软件，设计3因素3水平的响应面分析共17组实验，中心组合试验设计方案及其结果见表3。

表3 中心组合试验设计水平方案及结果

2.3.2 回归分析 根据响应面数据进行回归分析，拟合获得失重率(Y1)和维生素C含量(Y2)的回归方程如下：

Y1=0.75+0.04A-0.021B-0.094C+0.077AB-0.088AC+0.13BC+0.035A2+0.21B2+0.19C2

Y2=0.42+0.011A+0.021B-0.030C+1.750E-003AB+0.049AC-2.750E-003BC-0.088A2-0.016B2-0.071C2

依据响应面数据进行回归分析，失重率(Y1)和维生素C含量(Y2)回归模型的系数显著性数据分析见表4、表5；回归模型方差分析结果见表6、表7。

表4 失重率回归模型的系数显著性数据分析结果

表5 Vc含量回归模型的系数显著性数据分析结果

表6 失重率回归模型方差分析结果

表7 Vc含量回归模型方差分析结果

依据表4和表5可知，回归方差分析表，此回归模型p<0.01说明方差模型显著，失拟项p=0.051 7和p=0.068 3>0.05，说明失拟项不显著，此方程模拟的3因素3水平实验分析是可行的。由表6、表7可知，失重率回归模型相关系数R12=0.994 3，维生素C含量回归模型相关系数R22=0.999 8，说明该模型的拟合程度表现为良好，且实验的误差较小，所以可用此模型来筛选出番茄保鲜效果最好的连翘精油天然复合保鲜涂膜液配方。

从表4可知，A(连翘精油)和B(ε-聚赖氨酸)的p<0.05，C(Nisin)的p<0.01，说明连翘精油和ε-聚赖氨酸对番茄贮藏期间失重率均是显著，Nisin对番茄贮藏期间失重率是显著；AC项、BC项对番茄失重率的影响为显著(p<0.01)，二次项(B2、C2)对番茄的失重率影响为显著。从表5可知，A(连翘精油)、B(ε-聚赖氨酸)和C(Nisin)的p<0.01，说明连翘精油、ε-聚赖氨酸和Nisin对番茄贮藏期间维生素C含量均是极显著，二次项(A2、B2、C2)对番茄维生素C含量影响均为显著，这表明各因素对响应值(Y)的影响不是简单的线性关系。

2.4 响应面交互因素分析

2.4.1 ε-聚赖氨酸番茄贮藏期间各交互因素对失重率的影响 由图5～图7可知，等高线呈现出椭圆形状，说明两个因素之间存在显著交互作用，且响应面的曲面较陡峭，表明因素间交互作用影响显著。响应面图5结果显示B轴方向的坡度较A 轴较陡，表明ε-聚赖氨酸对番茄失重率的影响程度比连翘精油较大。响应面图6结果显示C轴方向的坡度较A 轴较陡，表明Nisin对番茄失重率的影响程度比连翘精油较大。最终各因素极值浓度为：ε-聚赖氨酸在0.44%～0.66%左右；连翘精油在1.0%～1.83%左右；Nisin的极值浓度在0.43%～0.58%左右。

图5 连翘精油与ε-聚赖氨酸交互作用对番茄失重率的等高线和响应面

图6 连翘精油与Nisin交互作用对番茄失重率的等高线和响应面

图7 ε-聚赖氨酸与Nisin交互作用对番茄失重率的等高线和响应面

2.4.2 番茄贮藏期间各交互因素对维生素C含量的影响 由图8～图10可知，等高线呈现出椭圆形状，说明两个因素之间存在显著交互作用，且响应面的曲面较陡峭，表明因素间交互作用影响显著。响应面图8结果显示B轴方向的坡度较A 轴较缓，表明连翘精油对番茄贮藏期间维生素C含量的影响程度比ε-聚赖氨酸较大。响应面图9结果显示A轴方向的坡度较C轴较陡，表明连翘精油对番茄贮藏期间维生素C含量的影响程度比Nisin较大。响应面图10结果显示B轴方向的坡度比C轴较缓，表明Nisin对番茄贮藏期间维生素C含量的影响程度比ε-聚赖氨酸较大。最终各因素对番茄贮藏期间维生素C含量极值浓度范围：ε-聚赖氨酸在0.48%～0.70%左右；连翘精油在1.41%～1.68%左右；Nisin的极值浓度在0.31%～0.62%左右。

图8 连翘精油与ε-聚赖氨酸交互作用对番茄维生素C含量的等高线和响应

图9 连翘精油与Nisin交互作用对番茄维生素C含量的等高线和响应面

图10 ε-聚赖氨酸与Nisin交互作用对番茄维生素C含量的等高线和响应

2.5 验证性结果分析

响应面优化得到的连翘精油涂膜液复合配方为：连翘精油1.46%、壳聚糖2.0%、ε-聚赖氨酸0.52%、Nisin0.05%，在此条件下，番茄储藏期间失重率为0.7492%，维生素C含量为0.4189 mg/g。结合实际情况调整最优复合涂膜液配方为：连翘精油1.50%、壳聚糖2.0%、ε-聚赖氨酸0.50%、Nisin0.05%，在该条件下，番茄储藏期间失重率为0.75%，维生素C含量为0.42 mg/g。试验失重率较低，维生素C含量较高，与模型理论预测值相差甚小，表明能把该响应面优化配方应用于番茄保鲜。

3 结论与讨论

3.1 结论

(1)连翘精油对金黄色葡萄球菌抑菌效果比大肠杆菌更为显著，且抑菌效果均随着其组分浓度的增加，抑菌活性呈现上升趋势。

(2)单因素实验中对番茄储藏期间的失重率、维生素C含量变化的趋势分析表明：对番茄影响最重要的三个因素为连翘精油、ε-聚赖氨酸和Nisin。

(3)响应面配方优化实验得出复合涂膜保鲜液的最佳配比为：连翘精油1.50%、壳聚糖2.0%、ε-聚赖氨酸0.50%、Nisin0.05%；在25℃、相对湿度65%的条件下，番茄储藏10 d，失重率为0.75%，维生素C含量为0.42 mg/g。

3.2 讨论

(1)研究采用超临界流体CO2技术提取的连翘精油，其提取率与何勇[21]优化连翘精油提取实验得出数据相吻合。

(2)研究制备的复配型生物涂膜保鲜液在果蔬的应用上更加安全稳定，一定程度上弥补了使用单一防腐剂抑菌保鲜效果的缺陷。

(3)笔者研究不足之处是连翘精油具有一定的挥发性，长期贮藏未密封包装的食品，保鲜效果会下降，建议与低温贮藏相结合效果较佳。

(4)研究未对复合保鲜膜的机理进行探讨，也未对保鲜涂膜的性能进行测评。在以后研究中，应当进行相关研究，以期为连翘精油-ε-pL-Nisin复合涂膜保鲜液实际应用于食品防腐保鲜提供技术支持。