枇杷叶中熊果酸的提取工艺及含量测定研究

张小斌，雷艳妮，陈书存

(1.商洛学院 健康管理学院、中国中医科学院商洛中药材GAP科研工程中心,陕西 商洛 726000；2.商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000；3.商洛市中医医院，陕西 商洛 726000)

专业领域将蔷薇科植物枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.)的干燥叶定义为枇杷叶，枇杷叶在我国的主要产地大多分布在福建与湖北，其性质属寒，味道苦涩，在过去的中国药典中记录的枇杷叶功效非常多，临床上枇杷叶的使用范围非常广泛[1]。枇杷叶可以去火清肺，对于止咳化痰也有一定的作用，可以缓解人体许多脾胃慢性病[2]。枇杷叶的成分较为复杂，包括挥发油与酸性物质，当前阶段的科学研究证明使枇杷叶含有如此高的药用价值的元素主要是三萜化合物[3]。科学领域分离枇杷叶的构成成分，得出的乌苏烷型等化合物都是三萜酸类化合物，在所有化合物中，熊果酸的含量占比值最大，研究价值最高[4]。研究者鞠建华等人以枇杷叶为研究对象，展开了一系列的基础研究与深入研究，结果表明枇杷叶只所有具有止咳化痰等功效，与其含有的三萜酸类化合物有密切的关系，而熊果酸可以作为一个化合物代表，判断枇杷叶的药用价值可以从其含有的熊果酸的量大小入手[5]。在生物学层面，熊果酸也具有很高的使用价值，其具有抗癌功效，可以减少很多致癌物质对人体的损害，抑制人体内肿瘤细胞的分裂[6],很有可能成为一种高效低成本的抗癌药物。最近几年，我国专业领域展开的很多研究都证明了熊果酸是枇杷叶呈现较高药物价值的主要成分，其对于调节人体的肝功能与胃功能都有很大作用，可以增强人体免疫力，未来熊果酸的应用范围很有可能得到扩展，在功能性食品方向上开拓市场[7]。使用较为精密的仪器与先进的技术测定枇杷叶中熊果酸的含量，给予一定的标准衡量枇杷叶的质量高低，推动医药领域生产出更多质量得到保证的枇杷叶药材。深入研究提取手段，争取在保证提取质量的前提下减少成本投入与过程中的资源浪费，可以开拓枇杷叶的市场，让枇杷叶的应用范围更加广泛。因为枇杷叶的功效涵盖范围较大，毒性非常小，因此近些年医学领域给予枇杷叶的重视程度越来越高。笔者以探索出更高效的熊果酸提取方法并精准测定出熊果酸含量为目标，为充分利用并开发枇杷叶资源提供一定的实验依据。

1 实验仪器与材料试剂

1.1 实验仪器

KS-150D型超声清洗器(济南松浦自动化设备有限公司)；1/10万天平(上海精密科学仪器有限公司制造)；FA2004N电子天平(上海精科天平)；101-1型干燥箱(中华人民共和国上海市实验仪器总厂)；高效液相色谱仪(日本岛津制作所)； BCD-207C电冰箱(无锡小天鹅)；HH-4数显恒温水浴锅(双列四孔，常州国华电器有限公司)；4.5 um微孔滤膜；1 mL一次性医用注射器(带针头)。

1.2 材料试剂

枇杷叶购于陕西香菊大药房，经商洛学院生物医药与食品工程学院制药工程系鉴定为蔷薇科植物枇杷属枇杷叶。对照样品中的熊果酸(中国药品生物制品检定所，批号110742-200314，供含量测定用)，甲醇、95%乙醇、乙醚、石油醚均为分析纯；甲醇、磷酸、乙腈均为色谱纯。

2 实验方法

2.1 工艺流程

枇杷叶挑拣、清洗、干燥→枇杷叶干品→粉碎过20目筛→枇杷叶粉末→称量→石油醚预处理→烘干→加提取溶剂→不同方法提取→过滤→制备供试品溶液→含量测定→实验结果→结果分析→结论

2.2 枇杷叶的处理

将枇杷叶正面的杂质和背面棕褐色的绒毛清洗干净，以免干扰实验。常见的枇杷叶干燥方法有真空干燥、热风干燥与冷冻干燥等。实验证明：不同干燥方法对枇杷叶中熊果酸含量均无显著影响[8]。鉴于商洛地区四、五月份温度、风力适宜，选择自然干燥。枇杷叶完全干燥后，用粉碎机粉碎，过二十目筛后将样品粉末置于锥形瓶中，加入石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次15 mL，15 min后倾去石油醚，烘干。将石油醚处理过的样品粉末置于真空干燥箱中备用。

2.3 制备对照品溶液

用仪器称量2 mg熊果酸，将称取后的熊果酸放于容量瓶中，容量瓶量程选为10 mL，向容量瓶中添加甲醇，稀释溶液至溶液凹液面最低处达到刻度线，摇晃均匀，配成熊果酸浓度为0.2 mg/mL的溶液，过滤后注入进样瓶中备用。

2.4 样品溶液的制备

量取0.5 g枇杷叶粉末，量取前粉末应过20目筛，置于100 mL具塞锥形瓶中，用石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次15 mL倾去石油醚，烘干，加甲醇45 mL，冷浸30 min后，超声提取40 min，提取2次，合并滤液，最后将合并均匀的溶液倒入容量瓶中，容量瓶量程为100 mL，添加甲醇定容。取适量于0.45 um微孔滤膜过滤后备用。

2.5 色谱条件

色谱条件LichrospherCl8(250 mm×4.6 mm，5 um)色谱柱；流速:0.8 mL/min；柱温:室温；检测波长:215 nm。

2.6 方法学考察

2.6.1 流动相的考察 精密吸取对照品溶液20 ul，样品溶液20 ul，分别以①乙腈-甲醇-水-磷酸(80∶10∶10∶0.05)；②甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)为流动相，重复进样2次，记录色谱图，考察不同流动相对熊果酸分离效果的影响。

2.6.2 提取溶剂的考察 选取甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)为流动相，分别以甲醇、95%乙醇、乙醚为提取溶剂，超声提取20 min、30 min、40 min、50 min，其他条件不变，每种方法重复操作3次，制备溶液后各进样2次。将测定的熊果酸峰面积进行记录，根据测量结果计算出其平均值。

2.6.3 考察溶剂用量 提取溶剂选为甲醇溶液，提取过程所用时间约为40 min，进行两次提取，设置溶剂用量为15 mL、30 mL、45 mL、60 mL，每种方法重复操作3次，制备溶液后各进样2次。将测得的熊果酸峰面积进行记录，并且根据测量结果计算出其平均值。

2.6.4 提取时间的考察 以甲醇45 mL为提取溶剂，提取次数2次，提取时间设置为20 min、30 min、40 min、50 min，每种方法重复操作3次，制备溶液后各进样2次。将测得的熊果酸峰面积进行记录，并且根据测量结果计算出其平均值。

2.6.5 提取次数的考察 以甲醇45 mL为提取溶剂，提取过程所用时间约为40 min，分别进行一次、两次、三次、四次提取，每种方法重复操作3次，制备溶液后各进样2次。将测得的熊果酸峰面积进行记录，并且根据测量结果计算出其平均值。

2.7 样品含量计算方法

使用精密仪器，从对照品溶液中吸取出20 mL，从样品溶液中吸取出20 mL，装进样本瓶中，分别测定二者的熊果酸峰面积并记录下来，将记录数据代入进下式来计算熊果酸含量多少。

式中：AX为样品的峰面积；

CR为对照品溶液的浓度；

AR为对照品的峰面积；

S 为样品体积；

W 为称样量。

3 结果与分析

3.1 色谱条件的考察结果

色谱条件的考察结果见色谱图1、图2、图3。

图1 枇杷叶样品典型色谱

图2 对照品溶液典型色谱

图3 枇杷叶样品典型色谱

色谱图1是在流动相系统①乙腈-甲醇-水-磷酸(80∶10∶10∶0.05)下熊果酸样品色谱图，熊果酸保留时间为34 min左右，时间较长；色谱图2是以②甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)为流动相的熊果酸对照品色谱图，熊果酸保留时间为18 min左右，图形基线较为稳定，未出现峰形拖尾情况；色谱图3为流动相②条件下枇杷叶样品典型的色谱图，熊果酸峰与其它峰可以完全分离，基线平稳，峰形形状对称，未出现拖尾情况，并且流动相系统②中各组分价格更为低廉，考虑经济、操作等因素，流动相系统选择②。

甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)流动相中，添加剂为磷酸，作用是制造弱酸性环境，利于熊果酸的分离，同时起到改善峰形的效果[9]。

3.2 提取溶剂的考察结果

不同提取溶剂和不同提取时间，熊果酸的含量结果见表1。

表1 不同提取溶剂、不同提取时间下熊果酸的含量比较

由表1可知：相同提取时间下乙醚对熊果酸的提取率较甲醇与95%乙醇而言相对较低，而甲醇和95%乙醇提取率相当，熊果酸含量(%)相差不大，进样后发现选择甲醇作为提取液的实验组杂质峰较少[25]，基本不会干扰到熊果酸含量的测定，基线较为稳定，具有很高的分离度，因此选择甲醇作为本实验的提取溶剂较为合适。

3.3 溶剂用量的考察结果

溶剂不同用量的考察结果见表2、图4。

表2 溶剂不同用量下熊果酸含量比较

由表2、图4可知，一定范围内，熊果酸的含量(%)随着溶剂量的提高而增加，当溶剂量达到45ml时，增加不再明显，此时熊果酸的含量(%)达到0.798%。这是因为溶剂用量影响熊果酸的方面大体如下：条件相同的情况下，熊果酸溶解度基本不变，这个时候增加溶剂量，那么相对应的可溶解的熊果酸量也会增加，熊果酸的化学性质呈现出弱极性的特征，常温常压下不会与水相融，只能溶于甲醇，因此甲醇含量越高的溶剂越适于充分提取熊果酸。

3.4 提取时间的考察结果

提取时间的考察结果见表3、图5。

图4 溶剂用量对熊果酸的含量的影响

表3 不同提取时间下熊果酸含量比较

由表3、图5可知：熊果酸的含量(%)在提取时间20～30 min显著增加，30～40 min内，增加缓慢，40～50 min内几乎不再增加。这是因为随着时间的增加，熊果酸在甲醇中的浓度不断增加，初始时增加显著，之后逐渐变缓，40 min后，达到动态平衡，熊果酸在固液相间趋于平衡。因此我们选择40 min为最佳提取时间。

图5 提取时间对熊果酸的含量的影响

3.5 提取次数的考察结果

提取次数的考察结果见表4、图6。

由表4、图6可知，进行过两次提取过程后，熊果酸含量的增加趋势变得愈发减缓，因此合适的提取次数应该为2。提取次数越多，熊果酸含量同最终的提取溶剂量越接近，并且最终约等于相等，这是一个动态平衡的过程，代表着提取加速度的逐渐减少。考虑到时间、资源等问题选择提取次数为2次，此时熊果酸含量达到0.796%。

表4 不同提取次数下熊果酸含量比较

图6 提取次数对熊果酸的含量的影响

4 结论与讨论

(1)传统提取方法中选用的乙醇回流法、索式提取法操作复杂、花费时间长、提取率较低，利用空化效应以及超声波带来的震动，让有效成分同溶剂可以更快的相互融合，提高熊果酸的提取效率，减少提取过程投入的时间，还可以减少温度过高对实验结果造成的负面影响[10]。因此在枇杷叶有效成分熊果酸的提取方法中，选用超声提取法进行提取。

(2)通过查阅相关文献[11～13]，高效液相色谱法相对其他方法而言操作灵敏、快速、准确、重现性好，可以将这种方法作为控制枇杷叶药材质量的一个重要方法。

(3)该实验通过对提取溶剂、溶剂用量、提取时间、提取次数及流动相的考察可以得出结论:超声波提取法提取枇把叶中熊果酸的最佳工艺为：溶剂选择甲醇溶液，溶剂所需量为45 mL，提取时间为40 min，提取次数为2次。枇杷叶中的熊果酸含量采用高效液相色谱法进行测定，得出的色谱条件优化为：LichrospherCl8(250 mm x4.6 mm,5 um)色谱柱；甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.05)为流动相；流速:0.8 mL/min；柱温:室温；检测波长:215 nm。在此优化条件下枇杷叶中熊果酸提取率最高，含量达0.798%。这种实验方法具有简单的操作过程，需要投入的时间成本较低，重现性好，提取率高，为充分利用枇杷叶植物资源提供了一定的数据支撑，也可以有效控制枇杷叶药材的质量，值得推广应用。