TaqMan探针实时荧光PCR对马鹿真伪鉴别方法的建立

王 准，王向辉，刘 博，李文君，刘金华*

1.长春海关技术中心，吉林长春 130000；2.长春国际旅行卫生保健中心，吉林长春 130000

1 引言

我国是世界上鹿类资源最丰富的国家之一，据初步统计现养鹿约50万头，全国养鹿场达到4000多家[1]。根据对鹿科动物进化的研究，梅花鹿、马鹿、白鹿、白唇鹿、水鹿等均产自我国[2]。

鹿全身都是宝，民间称鹿茸为“宝中之宝”。其中最具药用价值的当属梅花鹿和马鹿。马鹿鹿茸产量很高，是名贵中药材。明朝名医李时珍曾在《本草纲目》中以“生经补髓，养血益阳，强筋健骨”来形容鹿茸。它的鹿胎、鹿鞭、鹿尾和鹿筋也是名贵的滋补品。随着人们生活水平的提高，鹿茸在食品、药品以及保健品行业的地位也越来越受重视。由于马鹿价格昂贵且与其伪制品在外观上难以辨别，为降低成本，常有一些不法分子为了牟取暴利常常鱼目混珠，坑骗消费者。为了获得高昂的利润而进行的造假、贩假不仅使消费者在经济上、精神上受到损害，而且也给构建和谐的市场秩序造成了严重危害。

目前国内外主要通过直观性状鉴定和常规理化鉴定，来分辨鹿产品的真伪，但是伪制品用这两种方法极难准确鉴定[3]。建立一种快速有效的检测方法即保护了市场秩序从而也使消费者的利益不受侵害。

目前，人们对于如猪、牛、羊、马、鸡、鸭等动物源性成分的检测都进行了研究，但鲜有对马鹿的快速、简单、特异且灵敏地鉴别研究。其主要根据凝胶电泳的条带片段大小来判断是否含有鹿源性成分，该方法存在灵敏度低，操作复杂，耗时长，容易污染出现假阳性等特点。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的马鹿的真伪鉴别方法，进行中药材马鹿茸真伪的鉴别。不同鹿科物种的线粒体控制区存在差异性，通过设计特异性寡核苷酸引物及探针来检测。该方法操作简便，并且在技术上不仅具有更强的特异性和更高的测量灵敏度，大大缩短了测量检测时间，达到了稳定、可靠、周期短、成本低廉的效果，而且减少了在条件简陋的基层检测单位因检测环境等因素带来的污染可能。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料与试剂

鹿科物种：马鹿肉、马鹿茸、梅花鹿心、驯鹿角、白臀鹿肉；非鹿科属：貉肉、羊肉、猪肉、牛肉、鸡肉、马肉、鹅肉、鸭肉等。以上动物材料均为实验室自存；核酸提取试剂盒；TaqMan实时荧光 PCR 预混合液；引物、TaqMan探针。

2.1.2 仪器

HeraeusFresco21型冷冻离心机；Mili-Q纯水器；innupure c16 touch核酸自动提取工作站；ABI Q7实时荧光定量PCR仪。

2.2 实验方法

2.2.1 样本DNA的提取

用商品化试剂盒（smartDNAprep）提取鹿科属和非鹿科属的DNA模板。

2.2.2 引物和探针的设计

根据GenBank中马鹿线粒体控制区基因序列，同时通过NCBI-BLAST进行同源性比对，选择特异性的基因区间，利用Primer Express 3.0.1软件，设计特异性引物、探针（见表1）。

表 1 马鹿物种的特异性引物、探针

2.2.3 实时荧光PCR检测方法的建立

实时荧光PCR反应体系组分为：TaqmanUniversalMasterMix（2×）12.5 µL，上游引物（10 µmol/L）0.5 µL，下游引物（10 µmol/L） 0.5 µL，TaqMan探针（10 µmol/L）0.5 µL，DNA模 板5 µL，加ddH2O至总体积为25 µL。

实时荧光扩增程序为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 预变性10 min ；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸60 s， 45个循环；在退火延伸（60 ℃）时进行收集荧光信号。

2.2.4 特异性实验

提取马鹿肉、马鹿茸DNA模板作为阳性对照、提取梅花鹿血、驯鹿角、白臀鹿肉、貉肉、羊肉、猪肉、牛肉、鸡肉、马肉、鹅肉、鸭肉等DNA模板作为阴性对照，并对其扩增，从而根据Ct值来验证引物和探针的特异性。

2.2.5 敏感性实验

将马鹿DNA模板10倍稀释为5个梯度：1.7、 0.17、0.017、0.0017、0.00017 ng/μL 作为模板，重复测定2次，确定最小检测量。

3 结果与分析

3.1 特异性试验结果

结果显示，在FAM荧光通道下马鹿肉和马鹿茸的DNA模板为典型的S型扩增曲线，而阴性对照样本均呈直线，即该方法能够特异性的对马鹿DNA进行检测（图1）。

图1 实时荧光PCR特异性扩增曲线结果（图1中，1为马鹿肉，2为马鹿茸）

3.2 敏感性验证结果

将马鹿DNA模板（1.7 ng/µL）10倍稀释为5个梯度（1.7 ng/µL～0.00017 ng/µL），进行荧光PCR检测。结果显示，其检测下限可达0.00174 ng/µL。

图2 实时荧光PCR敏感性实验结果（图2中，1～5浓度分别为1.74、0.174、0.0174、0.00174、0.000174 ng/µL）

4 结论与讨论

目前市场上的常见伪品：市面上售卖的鹿茸60%以上是以驯鹿制成的非药典品[4]；用猪皮包裹面粉，猪血的混合物再切片用以仿制马鹿茸；经过乙醇浸泡处理的真鹿茸，阴干过后的伪劣品充当真品售卖[5]，这种加工处理过后的鹿茸药用价值基本损失；以动物的骨骼、皮毛和色素加工而成[6]。尽管这些伪充品没有明显的副作用，但不良商家的这些举动严重的侵犯了消费者权益，对消费者身心造成了巨大伤害，影响了社会稳定。

随着现代科学技术的发展，掺伪水平和手段越来越高明，关于鹿产品的真伪鉴别方法也不断更新，从最早期的感官检验到后来通过色谱、光谱进行鉴别[7]，再到免疫学法[8]、基于Cytb基因鉴别法[9]、基于COⅠ序列鉴别法[10]等。但是由于多数检测方法易受不同品种及产地的鹿产品中所含有的化学成分影响，掺伪成分越来越复杂，这些因素严重限制了传统检测方法的应用空间，局限性较大。而通过荧光基团的信号变化特异性的检测到种的水品，缩短了检测时间的同时也提高了检测的准确性，为动物源性成分定性提供有效的技术保障[11～13]。TaqMan实时荧光PCR技术的应用，会促进PCR技术在中药材、食品及医疗领域的发展，它保证了食品药品安全，更是为市场监督管理提供技术依托的检测机构提供了巨大的便利，同时对于打击假冒伪劣鹿产品、保障消费者权益和维护市场秩序更具有深远意义。