非洲猪瘟病毒MGF505-3R蛋白的原核表达研究

王凤杰，魏 天，张芳毓，王成宇，张守峰，扈荣良，吕礼良，王永志

1.中国农业科学院长春兽医研究所，吉林长春 130122；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130124

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要通过蜱传播。该病以呼吸障碍，全身出血为主要临床特征，病程短，发病率和死亡率高达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告疫病，我国将其列为一类传染病。

ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是由共价封闭的双链DNA分子组成的具有线性基因组的二十面体DNA病毒，直径为175～215 nm，基因组在170～193 kb之间，共编码150～200个开放阅读框（ORFs）。ASFV基因组中约30%的ORFs存在多个拷贝，即多基因家 族，包 括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530。其中MGF505基因家族包括MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R，它们在病毒的感染过程中发挥着重要作用。有研究表明MGF505与病毒的复制及毒力有关，敲除ASFV强毒株或弱毒株MGF505的某些基因，会大大降低病毒在巨噬细胞内的复制效率，除此之外，MGF505的编码蛋白也可抑制正常I型干扰素的表达[1]。本研究成功构建出MGF505-3R重组质粒并在大肠杆菌中原核表达，纯化后得到纯度较高MGF505-3R重组蛋白，为MGF505蛋白的研究奠定了基础，为ASFV MGF505基因缺失疫苗相关免疫学方面的鉴别检测和诊断提供前期技术支持。

1 材料

1.1 质粒、ASFV阳性血清

AFSV基因组DNA、ASFV阳性血清均由军事医学科学院军事兽医研究所保存。

1.2 主要试剂

ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker、XhoⅠ限制性内切酶、EcoRⅠ限制性内切酶、In-fusion HD® Cloning kit连接试剂盒，均购自TaKaRa公司；兔抗鼠HRP-IgG，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，购自长春飞凯生物有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自天根生化（北京）科技有限公司； Transetta（DE3）大肠杆菌感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。

2 方法

2.1 引物设计

依据GenBank上非洲猪瘟病毒MGF505-3R（登录号:NC_044959.1）基因序列，利用Lasergene 7.1设计具有酶切位点、His标签和同源臂的特异性引物。

引物序列：F5’-TGGGATCCCCGGAATTCATGTCCTC TTCTCTTCAGGAAC -3’，R5’-CGATGCGGCCGCTCGAGC TAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCTTTCCCAGGTTTCGA AG-3’。

2.2 MGF505-3R基因的扩增、鉴定

以军事医学科学院军事兽医研究所保存的非洲猪瘟基因全序列质粒为模板，PCR反应体系（20 µL）：上、下游引物（10 pmol/µL）各1 µL，ExTaq DNA Polymerase Mix 10 µL，模板0.5 µL，加双蒸水补至20 µL。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

2.3 MGF505-13L原核表达载体的构建

使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收2.2步骤的PCR产物。使用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pGEX-6p-1原核表达载体并回收DNA。使用Super Fusion Cloning Mix（2×）连接酶将MGF505-3R基因片段和pGEX-6p-1原核表达载体连接。将连接好的重组质粒转入Transetta（DE3）大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落经PCR初步验证后，阳性克隆由吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定。

2.4 MGF505-3R重组蛋白的原核表达及SDS-PAGE分析

取50 µL MGF505-3R阳性菌液按1:1 000接种至5 mL LB液体培养基（氨苄青霉素100 µg/mL），37 ℃震荡培养12～16 h；将扩增好的菌液按照1:100的比例加入LB液体培养基（氨苄青霉素100 µg/mL），37 ℃震荡培养至OD=1时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37 ℃摇床震荡诱导2 h。分别将诱导前后的菌液离心，用无菌水重悬菌体，冰水浴超声破碎菌体，4 500 r/min 4 ℃离心15 min后收集上清液和沉淀。分别取80 µL上清液和沉淀与20 µL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合，沸水浴5 min，冰水浴5 min，12 000 r/min 4 ℃ 离心2 min；取10 µL上清液和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色后分析目的蛋白的表达情况。

2.5 MGF505-3R重组蛋白的纯化

通过SDS-PAGE分析显示，MGF505-3R重组蛋白以包涵体形式表达。包涵体沉淀用1×PBST缓冲液洗涤后溶解于pH 8.0的8 mol/L尿素，12 000 r/min离心10 min收集上清液，上清液用0.45 µm滤膜过滤后加入已经平衡好的Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱，流速1 mL/min，收集滤液，重复3次循环加入层析柱，用pH6.0的8 mol/L尿素洗涤杂蛋白，用pH4.0的8 mol/L尿素洗脱目的蛋白。将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。通过BCA法测定蛋白浓度。

2.6 Western-blot鉴定

将纯化后的重组蛋白凝胶转印至PVDF膜，以5%脱脂奶粉封闭，使用1:5 000倍稀释的ASFV阳性血清孵育1 h，洗涤5次；以HRP标记的兔抗鼠二抗1:10 000稀释后孵育1 h，洗涤5次；加入DAB显色，观察重组MGF505-3R蛋白的反应原性。

3 结果与分析

3.1 PCR的检测结果

对MGF505-3R基因进行扩增，PCR产物用1% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，扩增片段与目的片段（843 bp）大小一致。

3.2 原核表达载体的构建与测序鉴定

将载体pGEX-6p-1酶切产物和MGF505-3R的PCR产物经In-fusion HD® Cloning kit连接试剂盒连接，转化至Transetta（DE3）感受态细胞中。挑取单菌落PCR验证，阳性克隆由库美生物公司测序。测序结果使用seqman软件分析，结果表明该序列与GenBank中收录的MGF505-3R基因序列的相似性为99%，成功引入His标签，且编码框插入正确。

3.3 MGF505-3R重组蛋白的原核表达及SDS-PAGE分析

利用鉴定为阳性的MGF505-3R原核表达菌株进行原核诱导表达，超声破碎菌体后进行SDS-PAGE电泳。结果显示，MGF505-3R重组蛋白主要在沉淀中以包涵体的形式表达，蛋白条带大小为53 ku符合预期值。

3.4 MGF505-3R重组蛋白的纯化及SDS-PAGE分析

使用包涵体常规纯化方式对MGF505-3R重组蛋白进行Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化，获得纯度较高的目的条带。

3.5 Western-blot分析

抗ASFV抗体与转染到Pvdf膜上的MGF505-3R重组蛋白可以反应，以ASFV同样具有GST和His双标签的重组P72蛋白为阳性对照，植物病毒蛋白为阴性对照，经DAB显色后，在53 ku处有一条明显特异性条带，表明重组蛋白具有良好的表达活性。

4 讨论

ASFV具有庞大的基因组，可编码多种蛋白质，拥有十分复杂的免疫逃逸机制。MGFs约占ASFV基因组ORFs的30%，编码的多个拷贝，为病毒提供了选择进化的优势，尽管单个MGF基因的功能是未知的，但已有研究显示MGF360和MGF505是促进感染细胞存活和抑制I型干扰素反应所必需的基因[2]。针对MGFs基因缺失疫苗的研究也是目前ASF疫苗研制的主要研究方向。

原核表达系统是基因表达技术中发展最早，应用最广泛的经典表达系统，与其它表达系统相比，其优点在于方法简单、用时短、而且所需的成本低廉。但蛋白产物由于没有真核生物的修饰，不一定具有天然的活性。蛋白也常以包涵体的形式表达，不易提取。本研究将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上，转入表达菌株Transetta（DE3）中进行体外诱导表达，实现了目的基因的高效表达，但目的蛋白主要以包涵体形式表达，不具有生物学活性，除了与复性过程性质相关外，还与蛋白质本身特性有关。

本实验成功克隆出引入His标签的MGF505-3R基因片段，以pGEX-6p-1为载体构建出带有GST、His双标签的MGF505-3R重组质粒，原核表达并纯化，获得纯度较高的MGF505-3R重组蛋白，Western-blot对重组蛋白进行血清学分析，检测出其具有良好的表达活性。本实验为MGF505蛋白的后续研究打下了基础，为ASFV MGF505基因缺失疫苗相关免疫学方面的检测提供前期技术储备。