宰后不同部位牛肉保水性变化和蛋白质特性研究

左惠心，温彬，罗欣，朱立贤，牛乐宝，张一敏，毛衍伟

(山东农业大学 食品科学与工程学院，山东 泰安，271018)

保水性(water-holding capacity，WHC)是指肌肉保持其原有水分与添加水分的能力[1]，牛肉保水性的大小与嫩度、风味、多汁性和营养价值等食用品质密切相关[2]。在屠宰、加工、贮藏和运输过程中，牛肉中的汁液会不可避免地发生损失，流失的汁液在很大程度上影响了肉品品质、造成经济损失[3-4]。对于生鲜肉和肉品加工行业来说，保水性是当今最重要的肉品品质之一[5]。研究表明，不同部位牛肉的保水性存在差异[6]，但不同部位牛肉保水性存在差异的原因尚不明确。近年来，小包装分割冷鲜肉销量逐年上升，人们更加关注畜禽肉不同部位之间食用品质的差异[7]。因此，研究不同部位肌肉保水性的变化规律及其差异因素，不仅具有重要的理论价值，而且具有重要的经济意义。

研究表明，肉品保水性受蛋白质空间结构的变化、肌球蛋白和肌动蛋白丝间净电荷作用的影响[8-9]。SCHFER等[10]指出，细胞骨架蛋白在肉品成熟过程中结构变化会引起细胞形态以及肉品保水性的改变。LAWSON等[11]研究表明连接细胞骨架和胞外基质的整合素蛋白对猪肉中汁液流失通道的形成至关重要。ZHANG等[12]也有类似的研究结果，其研究发现肌间线蛋白的完整性、整合素蛋白的降解、μ-钙蛋白酶含量与宰后猪肉的保水性变化有关。这些研究说明肌纤维结构变化、水分溢出、汁液流失通道等与汁液损失有重要联系，可以解释大部分汁液流失现象。然而，这些研究并不能对肉的保水性提供完整的解释，也无法直接证明是否是蛋白质的降解导致肉中水分的流失。LI等[13]运用差示扫描量热仪(differential scanning calorimetry，DSC)研究了冷却猪肉在成熟过程中保水性变化与蛋白质变化的关系，结果表明，在成熟过程中蛋白质发生降解，且与肌浆蛋白变性程度呈显著负相关关系(R=-0.91,P<0.05)。MA等[14]对成熟过程中不同部位肌肉的蛋白水解变化与肉品品质特性进行了相关性分析，结果表明，在成熟过程中，不同部位肌肉的蛋白质水解变化是以其特有的方式发生的，这可能导致成熟过程中不同肌肉的肉质变化速率和程度不同。

本研究以冷却牛背最长肌、半膜肌和腰大肌作为研究对象，在各成熟时间点采集样本，测定蛋白质化学作用力的变化；并运用DSC测定肌肉蛋白质的变性程度。通过研究蛋白质化学作用力变化和蛋白质热变性规律变化，从蛋白质特性变化的角度分析不同部位牛肉保水性存在差异的原因，以期为全面阐明宰后不同部位牛肉保水性机制提供新视角，为分割牛肉市场价值和加工特性的提高提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用牛肉样品采自山东省阳信县某公司，挑选8头体重相近，18～24月龄左右的杂交公牛(鲁西黄牛×西门塔尔牛)，按照伊斯兰屠宰方式屠宰，胴体在排酸库冷却成熟24 h后，取左半胴体的背最长肌(第12根胸肋到腰椎末尾)、半膜肌、腰大肌部位，将肉样于4 ℃环境温度下运回实验室，对肉样分割成2.54 cm厚度的牛排并进行托盘包装，进行后续试验。

氯化钠(分析纯)，天津市凯通化学试剂有限公司；无水乙醇、磷酸盐缓冲液，国药集团化学试剂有限公司；尿素、Lowry法蛋白定量试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AB104-S分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；BD-145HDE冷藏冷冻转换柜，青岛海尔特种电冰柜有限公司；5804R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；IKA T18匀浆机，艾卡仪器设备有限公司；YYW-2应变控制式无侧限压力仪，南京土壤仪器厂有限公司；SpectraMax M5酶标仪，美国Molecular Devices公司；DSC-200PC差示扫描量热仪，德国NETZSCH公司。

1.3 实验方法

1.3.1 失水率的测定

参照FRANCO等[15]的方法并稍加修改，用取样刀从牛排样品中切取1 cm厚的均匀薄片，平置在洁净的橡皮片上，用直径为2.523 cm的圆形取样器切取中心部肉样，立即用感量为0.001 g的天平称重(m1)，并记录，然后放置于铺有18层定性滤纸的压力仪平台上，肉样上方再放18层定性滤纸，加压至35 kg，保持5 min，中间不断调节维持35 kg压力。滤纸的层数可根据样品保水性情况调整，以水分不透出、能够全部吸净为度。撤除压力后，再次称重记为m2。重复3次取平均值。失水率计算如公式(1)所示：

(1)

1.3.2 化学作用力的测定

1.3.3 肌肉蛋白质稳定性分析

参照DENG等[18]和LI等[13]的方法，将冷冻样品(10～15 mg)在-20 ℃的封闭冷冻箱中制备，密封在铝坩埚中并称重。将样品在20 ℃下静置2 min，DSC仪器测定温度为20～100 ℃，升温速率5 ℃/min。用空坩埚作为热分析的参考。使用仪器自带软件进行热图分析，其中确定了显著吸热峰的最高温度Tmaxpeak，并计算热变性焓DHpeak作为峰面积。

1.4 数据分析

数据采用IBM SPSS Statistics 20.0软件以成熟时间、部位为固定因子，采用一般线性模型进行统计分析，用多重比较选择比较主效应因素，采用Orign 2018软件对数据作图。所有结果以平均值±标准误(mean±SE)的形式表示。

2 结果与分析

2.1 不同部位牛肉成熟过程中失水率变化

失水率，即加压损失，反映肌肉中自由水的含量。如表1所示，成熟时间和部位对失水率影响极显著(P<0.01)，部位和成熟时间的交互作用对失水率影响显著(P<0.05)。可以看到，在整个成熟期间，半膜肌的失水率显著高于背最长肌和腰大肌(P<0.05)，说明腰大肌的保水性显著高于背最长肌和半膜肌(P<0.05)。成熟过程中，不同部位牛肉的失水率呈现先上升后下降趋势(P<0.05)，在成熟3 d时达到最大值。

表1 不同部位牛肉成熟过程中失水率变化Table 1 The rate of pressure loss in different parts of beef during postmortem aging

2.2 不同部位牛肉成熟过程中化学作用力的变化

ZHANG等[12]研究发现，牛肉宰后成熟过程中蛋白质会发生降解。ZENG等[19]认为，肌纤维结构蛋白的完整性会对肉品的保水性具有显著影响。离子键、氢键和疏水性相互作用力作为维持蛋白质三级结构的主要作用力，其值的变化可以反映蛋白质的变性程度[20]。

3种部位牛肉在成熟过程中离子键的变化如图1所示，不同部位牛肉之间的离子键作用力均无显著差别(P>0.05)，仅成熟时间对离子键作用力影响显著(P<0.05)。在成熟前5 d离子键作用力变化不显著(P>0.05)，成熟第7天时显著升高(P<0.05)。

图1 不同部位牛肉成熟过程中离子键作用力的变化Fig.1 Changes in ionic bond force in different parts of beef during postmortem aging注：不同字母表示不同成熟时间差异显著(P<0.05)

图2表示3种部位牛肉在成熟过程中氢键的变化。对于氢键作用力，部位、成熟时间和其交互作用对氢键作用力影响显著(P<0.05)，在整个成熟期间内，背最长肌的氢键作用力1～3 d时显著升高至7.84 mg/mL，在成熟5～7 d时降低至5.93 mg/mL，呈现先升高后降低的趋势(P<0.05)，半膜肌和腰大肌的氢键作用力在成熟期间变化较复杂，但整体呈现为显著上升的趋势(P<0.05)。对比不同部位牛肉的氢键作用力，腰大肌的氢键作用力在成熟第2天和第5天时显著低于背最长肌和半膜肌(P<0.05)。

图2 不同部位牛肉成熟过程中氢键作用力的变化Fig.2 Changes in hydrogen bond force in different parts of beef during postmortem aging注：a～c不同字母表示同一部位不同成熟时间差异显著(P<0.05)，x～y不同字母表示同一成熟时间不同部位差异著(P<0.05)

3种部位牛肉在成熟过程中疏水性相互作用力的变化如图3所示。部位和成熟时间的交互作用对疏水性相互作用力影响显著(P<0.05)，各部位牛肉疏水性相互作用力在成熟期间的变化各不相同，背最长肌的疏水性相互作用力在成熟第3天降低至2.21 mg/mL后在第7天升高至3.34mg/mL(P<0.05)。半膜肌的疏水性相互作用力在成熟前5 d无显著变化(P> 0.05)，在成熟第7天降低至3.66 mg/mL(P<0.05)。腰大肌的疏水性相互作用力在1～3 d时由4.24 mg/mL显著升高至6.91 mg/mL，在3～7 d显著降低至4.66 mg/mL，呈现先升高后降低的趋势(P<0.05)。在成熟前3 d，半膜肌的疏水性相互作用力显著高于或不显著低于背最长肌与腰大肌(P<0.05)；成熟3～5 d，各部位的疏水性相互作用力无显著差异，维持在3.34～4.66 mg/mL。综合分析来看，成熟期间3种部位牛肉的化学作用力均发生不同程度的变化(P<0.05)，且不同部位牛肉的化学作用力的变化幅度各不相同。

图3 不同部位牛肉成熟过程中疏水性相互作用力的变化Fig.3 Changes in hydrophobic interaction force in different parts of beef during postmortem aging注：a～b不同字母表示同一部位不同成熟时间差异显著(P<0.05)，x～y不同字母表示同一成熟时间不同部位差异显著(P<0.05)

离子键、氢键和疏水性相互作用力作为维持蛋白质三级结构的主要作用力，其值的变化可以反映蛋白质的变性程度[16-17]。综合分析来看，成熟期内3种部位牛肉的化学作用力均发生不同程度的变化(P<0.05)，且不同部位牛肉的化学作用力的变化幅度各不相同。康怀彬等[17]分析认为，蛋白质空间结构的改变会导致蛋白质内疏水性基团发生暴露，随着蛋白质的变性，肽段的构象发生变化，同时生成了复杂的结构，进而降低了疏水性相互作用。总体而言，随着蛋白质发生降解、价键被破坏，蛋白质原有的构象发生改变，蛋白质无序程度增加[17]。GMEZ-GUILLÉN等[16]认为，相较于离子键作用力和氢键作用力，疏水性相互作用和二硫键等作用力在维持蛋白质空间结构时起主要作用。有研究表明蛋白分子作用力的变化与保水性具有一定关系。郭兆斌等[21]研究表明，蛋白质表面疏水性反映了蛋白质的水合特性，可以用来评价肌原纤维蛋白构象稳定性对保水性的影响；王静宇等[22]研究表明，肌原纤维蛋白凝胶保水性受氢键、静电相互作用、疏水相互作用和二硫键等相互作用力的影响。在本研究中，成熟期内3种部位牛肉的氢键作用力和疏水性相互作用力的变化和差异各不相同，离子键作用力仅第7天呈现显著升高的趋势(P< 0.05)，因此认为不同部位的牛肉蛋白质的化学作用力变化不同，化学作用力不是造成牛肉不同部位之间保水性差异的原因。

2.3 不同部位牛肉成熟过程中蛋白质稳定性的分析

根据1.3.3所述分析方法可得牛肉DSC变化的一般曲线，以此图为例，可以说明牛肉中肌球蛋白、肌动蛋白和肌浆蛋白变性的一般规律(图4)。DENG等[18]的研究表明，DSC热流图中出现的3种峰分别代表了肌球蛋白质头部(峰I)、肌球蛋白尾部和肌浆蛋白(峰II)与肌动蛋白的变化(峰III)；峰的顶点温度(Tmaxpeak)为蛋白质的变性温度，反映了蛋白质的稳定性，Tmaxpeak越高，其稳定性越好；各峰的峰面积为蛋白质的变性焓(DHpeak)，反映了蛋白质的变性程度，焓值越高，说明蛋白质变性程度越小[13, 18]。

图4 牛肉DSC曲线Fig.4 DSC curve of beef

由表2、表3可知，成熟时间与部位的交互作用对肌球蛋白头部的变性温度影响显著(P<0.01)，其中背最长肌和半膜肌在整个成熟时间内虽整体下降，但下降不显著(P>0.05)，腰大肌呈现显著下降的趋势，由55.03 ℃降低至54.14 ℃(P<0.05)。对于肌球蛋白头部的焓变值DHpeakI，仅成熟时间和部位作用显著(P<0.05)，交互作用不显著(P>0.05)，其中腰大肌的焓变值(0.14 J/g)显著低于背最长肌(0.15 J/g)与半膜肌(0.16 J/g)，说明腰大肌的肌球蛋白头部更容易变性，且随着成熟时间延长，3种部位牛肉DHpeakI的平均值由0.16 J/g降低至0.13 J/g(P<0.05)，表明3种部位牛肉的肌球蛋白头部均发生变性。对于TmaxpeakII及其焓变DHpeakII，其变化趋势与肌球蛋白头部变性的情况相同，总体随成熟时间呈现显著降低的趋势，且腰大肌的变性温度(63.56 ℃)与焓变(0.28 J/g)均显著低于背最长肌(63.94 ℃，0.31 J/g)与半膜肌(63.96 ℃，0.30 J/g)，表明腰大肌的肌球蛋白与肌浆蛋白更容易变性。

表2 不同部位牛肉成熟过程中蛋白质变性温度的变化Table 2 The protein denaturation temperature in different parts of beef during postmortem aging

表3 不同部位牛肉成熟过程中蛋白质变性焓的变化Table 3 The thermal denaturation enthalpies in different parts of beef during postmortem aging

对于肌动蛋白的变化，虽然TmaxpeakIII随成熟时间由第1天的77.56 ℃降低至第7天的77.49 ℃，整体呈现降低的趋势，但变化不显著(P>0.05)，且不同部位之间的差异性也不显著(P>0.05)，变性焓值的差异和变化与TmaxpeakIII类似，表明在整个成熟期内(7 d)3种部位牛肉的肌动蛋白降解程度低且稳定性高。综合整个DSC数据来看，在成熟期间内3种部位牛肉的肌原纤维均发生变性，且腰大肌的肌球蛋白与肌浆蛋白更易发生变性，且发生变性的程度更高。

在成熟过程中，细胞骨架蛋白(肌球蛋白、肌间线蛋白、肌动蛋白、肌联蛋白等)的降解对保水性的影响至关重要[23-24]。研究表明，肉品成熟过程中保水性的降低与蛋白质的变性有关[25-27]。以上结果表明，3种部位相比，腰大肌中肌球蛋白和肌浆蛋白更易变性，而腰大肌的保水性较好(表1)，换言之，腰大肌中蛋白质变性程度的增加降低了牛肉可渗出的水分。因此，推测肌球蛋白与肌浆蛋白的变性可能促进了肌肉结构对汁液的维持，在外力作用如加压状态下，减少了牛肉可流失的汁液。BERTRAM等[28]研究表明，肌球蛋白和肌动蛋白的变性与肉中的水分变化具有一定关系。陈韬[29]认为，不同保水性样品的肌球蛋白和肌浆蛋白的变性程度存在差异。在本研究中，成熟期间腰大肌的TmaxpeakI由55.03 ℃降低至54.14 ℃(P<0.05)，TmaxpeakII的均值为63.56 ℃，腰大肌的焓变值DHpeakI和DHpeakII也显示出相同的趋势，均显著低于背最长肌和半膜肌(P<0.05)。腰大肌的肌球蛋白与肌浆蛋白变性程度均高于背最长肌和腰大肌(P<0.05)，而保水性的结果却是腰大肌的保水性显著高于背最长肌和半膜肌(P<0.05)，分析认为随着成熟时间的延长，蛋白质降解、无序程度增加，肌细胞滞留水的能力更强[30]。因此蛋白质作为肌肉中固体物质的主要组成成分，蛋白质的变性对保水性起作用。

3 结论

在本研究中，成熟期内3种部位牛肉的氢键作用力和疏水性相互作用力的变化和差异各不相同，离子键作用力仅第7天呈现显著升高的趋势(P<0.05)，因此认为不同部位的牛肉蛋白质的化学作用力变化不同，化学作用力不是造成牛肉不同部位之间保水性差异的原因。DSC结果表明，腰大肌的蛋白质更易发生变性，且肌球蛋白和肌浆蛋白的蛋白质变性程度更高，蛋白质变性程度不同是引起不同部位之间牛肉保水性存在差异的原因。本研究通过探讨蛋白质特性改变对保水性的影响，明确不同部位牛肉保水性存在差异的原因，为提高牛肉的保水性提供理论依据。