大黄素对大鼠角膜碱烧伤后炎症因子表达及瘢痕形成的影响研究

陈金桃 徐志伟 伍海建 白建海

角膜碱烧伤属于严重眼外伤，可导致角膜混浊、瘢痕形成，若不及时干预可引发角膜盲[1]。研究显示，炎症反应及瘢痕形成是角膜碱烧伤后的主要病理现象，临床常采用皮质类固醇及抗代谢药物改善上述现象，但存在较多不良反应，临床应用受限[2]。因此，寻找安全有效的治疗药物抑制角膜炎症反应及瘢痕形成，对角膜碱烧伤后组织修复有重要临床意义。大黄素是从中药大黄中提取的活性蒽醌类化合物，具有显著抗炎、抗纤维化等多种生物学作用[3]。目前关于大黄素局部用药对角膜碱烧伤的作用及对角膜组织炎性反应及瘢痕形成影响的研究较少。为此，本研究构建角膜碱烧伤大鼠模型，观察大黄素局部用药对角膜组织炎症因子表达及瘢痕形成的影响，以期为临床角膜碱烧伤的治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级健康 SD 大鼠，75只，8周龄，雌雄不限，体质量240～280 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司[许可证号SCXK（京）2019-0010]，实验开始前所有大鼠均进行眼底拍照，排除眼部疾病。

1.1.2 主要试剂和仪器 大黄素（质量分数≥98%，上海融禾医药科技发展有限公司），IL-2、TNF-α、IFN-γ ELISA试剂盒（美国R&D公司），小鼠抗大鼠α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单抗、兔抗大鼠转化生长因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）、Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen，ColⅣ）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）多抗（一抗，美国BD公司），辣根过氧化物酶标记的相应二抗（美国Abcam公司）。SM2010R徕卡切片机（德国徕卡公司），SLM-KD4裂隙灯显微镜（上海三崴医疗设备有限公司），荧光共聚焦显微照相系统（德国Zeiss公司），PowerPac200电泳仪（美国Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1 角膜碱烧伤大鼠模型制备 75只大鼠以右眼为实验眼，参照文献[4]复制单侧角膜碱烧伤模型：3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，裂隙灯下检查角膜无感染；结膜囊内滴入4 g/L奥布卡因进行表面麻醉，直径为3 mm的圆形滤纸片（角膜环钻钻取）用浓度为1 mol/L NaOH溶液浸润，吸取多余溶液后，置于角膜中央30 s，立即取出滤纸片，用0.9%氯化钠溶液冲洗烧伤区1 min，可见灰白色灼烧斑，涂红霉素眼膏预防感染。以角膜灼烧程度Ⅲ级判定为模型复制成功。本研究剔除灼烧程度＜Ⅲ级、角膜穿孔、前房积血共11只，剩余64只大鼠进行后续实验。

1.2.2 分组及干预 模型复制成功大鼠64只采用随机数字表法分为模型组、大黄素低剂量组、大黄素中剂量组、大黄素高剂量组，每组16只。各大鼠的左眼健康角膜设为正常对照组。根据文献[5]确定大黄素对大鼠半数致死剂量为290 mg/kg体质量，给药剂量为半数致死量的1/20～1/10[6]，确定大黄素低、中、高剂量组的大黄素给药浓度为10、20、40 mg/kg。大黄素低、中、高剂量组分别用相应浓度大黄素滴眼50 μl，采用1%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液稀释，4次/d连续滴眼。正常对照组和模型组用1%DMSO溶液局部滴眼 50 μl，4 次/d 连续滴眼。

1.2.3 角膜浑浊度评分 各组取4只大鼠，于实验开始后第3、7、14、28天用裂隙灯显微镜评估角膜浑浊度：角膜透明记0分；虹膜纹理可见为轻度混浊，记1分；虹膜纹理不清为中度混浊，记2分；虹膜隐约可见为重度混浊，记3分；瞳孔不可见为极重度混浊，记4分。

1.2.4 组织取材 实验开始后第7天，各组处死12只大鼠，获取左右侧角膜组织，其中4只大鼠的角膜组织立即放入4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，制作厚度为6 μm的连续切片备用；其余8只大鼠角膜组织保存于-80℃冰箱备用。

1.2.5 病理组织学检查 取角膜组织的石蜡切片（4只），经二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化后，进行常规HE染色，常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明，中性树胶封片后于光学显微镜下观察拍照，每张切片统计5个随机视野内炎症细胞数，取平均值。

1.2.6 角膜组织IL-2、TNF-α、IFN-γ表达检测 取-80℃保存的角膜组织（4只），按照质量比1∶9加入0.9%氯化钠溶液，匀浆，匀浆液5 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），取上清液；采用ELISA法检测待测样本中炎症因子表达水平，按照试剂盒说明书步骤操作，酶标仪检测波长570 nm处吸光度值，根据建立的吸光度-浓度标准曲线计算待测炎症因子表达水平。

1.2.7 角膜组织中ColⅣ、α-SMA表达检测 取角膜组织的石蜡切片（4只），经脱蜡、水化、热修复后，加入封闭液封闭，分别滴加ColⅣ、α-SMA稀释一抗（1∶500）50 μl，置于湿盒 4 ℃孵育过夜，PBS 洗涤，滴加稀释二抗（1∶2 000）室温孵育 1.5 h，PBS再次洗涤，将含4,6-联脒-2-苯基吲哚（4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）的封片剂封片（避光操作），荧光显微镜下观察拍照，采用IPP6.0图像处理软件分析切片累积光密度值（integrated optical density，IOD），每只大鼠检测3张切片取平均值。

1.2.8 角膜组织TGF-β1、b-FGF蛋白表达检测 采用Western blot法。取-80℃保存的角膜组织（4只），加入4℃预冷组织裂解液，冰上裂解20 min，再进行组织匀浆，匀浆液于12 000 r/min离心15 min（离心半径12 cm），取上清液，沸水水浴10 min变性，再次离心后进行蛋白定量。取上清液，进行恒定电流的8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳2 h，电泳胶电转至硝酸纤维素膜上，封闭液室温封闭，加入稀释的TGF-β1、b-FGF 一抗（1∶400），4 ℃过夜，Tris-HCl+Tween 20缓冲盐溶液洗涤3次×10 min，加入稀释二抗（1∶2 000）常温孵育 2 h，TBST 再次洗涤，避光条件下进行电化学发光法显影，拍照后应用IPP图像分析软件定量分析，计算TGF-β1、b-FGF条带灰度值与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）灰度值的比值，以代表相应蛋白相对表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组内不同时点比较采用重复测量的方差分析，两两比较用LSD-t检验；多组比较采用单因素方差分析，两两比较用SNK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠碱烧伤前后裂隙灯下角膜大体表现碱烧伤前，各组角膜均正常；实验开始后第7天，模型组角膜混浊最为严重，大黄素低剂量组、大黄素中剂量组、大黄素高剂量组逐渐减轻，角膜中央逐渐透明，其中大黄素高剂量组减轻最为明显，见图1（插页）。

图1 各组大鼠碱烧伤后裂隙灯下角膜大体表现（a、a'：分别为正常对照组实验开始前、后；b、b'：分别为模型组实验开始前、后；c、c'：分别为大黄素低剂量组实验开始前、后；d、d'：分别为大黄素中剂量组实验开始前、后；e、e'：分别为大黄素高剂量组实验开始前、后）

2.2 各组大鼠碱烧伤后角膜浑浊度评分比较 与模型组比较，实验开始后第3、7、14、28天大黄素低剂量组、大黄素中剂量组和大黄素高剂量组角膜浑浊度评分均降低，且实验开始后第3、7天大黄素高剂量组低于大黄素低剂量组，实验开始后第14、28天大黄素高剂量组低于大黄素中剂量组，大黄素中剂量组低于大黄素低剂量组（P＜0.05）。随着实验时间的延长，各组角膜浑浊度评分呈先升高后降低趋势，实验开始后第7天角膜浑浊度评分最高（均P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠实验开始后角膜浑浊度评分比较（分）

2.3 各组大鼠角膜组织病理改变及炎症细胞计数比较 正常对照组角膜组织结构无异常，未见炎症细胞；实验开始后第7天，模型组角膜组织基质排列疏松，大量炎症细胞浸润；实验开始后第7天，大黄素低、中、高剂量组角膜组织基质排列相对整齐，炎症细胞浸润减少，见图2（插页）。模型组、大黄素低剂量组、大黄素中剂量组和大黄素高剂量组角膜组织炎症细胞计数分别为（51.60±3.47）、（28.60±2.91）、（17.80±2.40）、（10.40±2.11）个/视野。与模型组比较，大黄素低、中、高剂量组角膜组织炎症细胞计数均降低（均P＜0.05），且大黄素低剂量组＞大黄素中剂量组＞大黄素高剂量（均P＜0.05）。

图2 各组大鼠角膜组织病理改变（a：对照组；b：模型组；c：大黄素低剂量组；d：大黄素中剂量组；e：大黄素高剂量组；HE染色，×200）

2.4 各组大鼠角膜组织IL-2、TNF-α、IFN-γ表达水平比较 与正常对照组比较，模型组角膜组织IL-2、TNF-α、IFN-γ水平均升高（均 P＜0.05）；与模型组比较，大黄素低、中、高剂量组角膜组织 IL-2、TNF-α、IFN-γ水平均降低（均P＜0.05），且大黄素低剂量组＞大黄素中剂量组＞大黄素高剂量，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 2。

表2 各组大鼠对角膜组织IL-2、TNF-α、IFN-γ表达水平比较（μg/L）

2.5 各组大鼠角膜组织ColⅣ、α-SMA表达情况比较正常对照组角膜组织无ColⅣ、α-SMA表达，模型组角膜组织有大量ColⅣ、α-SMA表达。与模型组比较，大黄素低、中、高剂量组角膜组织ColⅣ、α-SMA免疫荧光IOD均降低（均P＜0.05），且大黄素低剂量组＞大黄素中剂量组＞大黄素高剂量组，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见图 3、4（插页）及表 3。

图3 各组大鼠角膜组织ColⅣ表达情况比较（a：正常对照组；b：模型组；c：大黄素低剂量组；d：大黄素中剂量组；e：大黄素高剂量组；免疫荧光法，×200）

图4 各组大鼠角膜组织α-SMA表达情况比较（a：正常对照组；b：模型组；c：大黄素低剂量组；d：大黄素中剂量组；e：大黄素高剂量组；免疫荧光法，×200）

表3 各组大鼠角膜组织ColⅣ、α-SMA表达情况比较（IOD）

2.6 各组大鼠角膜组织TGF-β1、b-FGF蛋白相对表达水平比较 与正常对照组比较，模型组角膜组中TGF-β1、b-FGF蛋白相对表达水平均升高（均P＜0.05）；与模型组比较，大黄素低、中、高剂量组角膜组织TGF-β1、b-FGF蛋白相对表达水平均降低（均P＜0.05），且大黄素低剂量组＞大黄素中剂量组＞大黄素高剂量组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5、表4。

图5 各组大鼠角膜组织TGF-β1、b-FGF蛋白免疫印迹图（a：正常对照组；b：模型组；c：大黄素低剂量组；d：大黄素中剂量组；e：大黄素高剂量组）

表4 各组大鼠角膜组织TGF-β1、b-FGF蛋白相对表达水平比较

3 讨论

角膜是屈光介质的主要组成部分，同时是维持角膜屏障的前体，理化损伤、药物、感染等多种因素均可引起角膜透明度降低，从而引起角膜盲[6]。碱烧伤是角膜盲常见原因，碱性化学物质可直接损伤角膜组织，同时继发性引起的炎症反应可导致角膜混浊、瘢痕形成等多种病理改变，抑制角膜碱烧伤后瘢痕形成对视力恢复有重要意义[7]。已有研究证实，大黄素抗炎及抗纤维化作用显著[8-9]，故本研究采用碱烧伤构建常见角膜损伤模型，重点观察大黄素对碱烧伤角膜组织炎症因子和瘢痕形成的抑制效果，并初步探讨其作用机制。

本研究发现，与模型组比较，给药第 3、7、14、28天大黄素各剂量组角膜浑浊度评分均降低，且给药期间大黄素高剂量组低于大黄素低剂量组；与模型组比较，大黄素各剂量组角膜组织炎症细胞计数及角膜组织IL-2、TNF-α、IFN-γ水平呈剂量依赖性降低，说明大黄素可有效抑制大鼠角膜碱烧伤后炎症因子表达，抑制炎症反应。大黄素属于蒽醌类天然活性成分，具有广泛药理学活性，其中抗炎作用已得到证实。任凯旋等[10]研究显示，大黄素可抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞分泌TNF-α等炎症因子分泌，抑制炎症反应。周丽艳等[11]应用大黄素局部给药治疗大鼠皮肤创伤，结果显示大黄素可加速创面愈合，促进表皮生长因子表达，说明大黄素局部给药治疗烧伤效果明显。上述研究与本研究结果共同提示，大黄素可通过激活巨噬细胞分泌多种抗炎因子，调节炎症反应，同时大黄素还可抑制内毒素诱导的促炎因子分泌，发挥炎症反应调节作用。

此外，本研究发现，与模型组比较，大黄素各剂量组角膜组织ColⅣ、α-SMA免疫荧光IOD及TGF-β1、b-FGF蛋白相对表达水平均降低，且呈剂量依赖性，提示大黄素可通过抑制TGF-β1、b-FGF表达发挥抑制大鼠角膜碱烧伤后瘢痕形成作用。角膜瘢痕形成是碱烧伤后重要病理改变，ColⅣ是角膜瘢痕形成过程重要胶原纤维，α-SMA是角膜肌成纤维细胞标志蛋白，具有特异性[12]。TGF-β1、b-FGF属于多功能生长因子多肽，参与成纤维细胞生长、分化等过程，存在于机体多种组织[13]。角膜碱烧伤过程中，TGF-β1、b-FGF表达上调，诱导角膜成纤维细胞激活，促进ColⅣ、α-SMA表达，继而导致角膜瘢痕形成[14]。Tian等[15]研究表明，大黄素可抑制博来霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1表达，同时可逆转肺上皮-间充质转化过程，发挥抗纤维化作用。Ma等[16]发现大黄素可通过抑制TGF-β1/Smad信号通路抑制大鼠肾纤维化过程。由此可见，大黄素可通过抑制TGF-β1、b-FGF表达发挥抗纤维化作用，从而抑制角膜瘢痕形成。

综上所述，大黄素可有效抑制大鼠角膜碱烧伤后炎症因子表达及瘢痕形成，可能通过抑制TGF-β1、b-FGF表达发挥抑制作用。大黄素局部用药对角膜碱烧伤形成的研究尚少，本研究为大黄素及其相关药物用于角膜碱烧伤、角膜炎、角膜瘢痕等患者的临床治疗提供了一定的理论支持，但仍需进一步设计实验观察大黄素对角膜碱烧伤的长期作用及深层机制。