基于RNA-seq的脂代谢相关基因Tmem176a功能分析

崔茂生, 段维旺, 李晓宁，汤 晨，李 凯, 周宇荀, 肖君华

(东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620)

随着人们饮食营养结构发生变化而越来越偏向高脂化，动脉粥样硬化[1]、冠心病[2]等心脑血管疾病发病率逐年升高。肝脏组织作为人体主要的脂质代谢器官，参与了脂质消化、吸收、合成、分解、运输等生理过程。因此，研究人员一直致力于寻找肝脏中与高脂响应相关的潜在基因，这对预防和治疗高脂血症具有重要意义。

Tmem176a属于跨膜蛋白位于人类染色体7q36.1，作为肿瘤早期诊断的生物标志物具有很高的临床价值。据报道，在人类癌症中经常发生杂合性丢失，Tmem176a启动子在人类结直肠癌[3-4]和食管癌[5]中频繁甲基化，并在这些癌症中发挥肿瘤抑制作用。然而Tmem176a在胶质母细胞瘤[6](GBMs)中具有肿瘤促进作用，并在细胞凋亡中起到中心作用，体现出Tmem176a功能具有组织特异性。

本研究使用Tmem176a的过表达载体plenti-CMV-Tmem176a-3FLAG-P2A-EGFP和siRNA-Tmem176a转染小鼠肝癌Hepa1-6细胞，将过表达、敲低的Tmem176a的Hepa1-6细胞进行RNA-seq分析，通过对转录组数据进行整理挖掘，利用生物信息学算法对差异表达基因进行基因GO注释和KEGG通路富集分析，为解析Tmem176a调控脂质代谢机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠肝癌Hepa1-6细胞，购自中国科学院细胞库,测序样本信息如表1所示，慢病毒表达载体Plenti-CMV-MCS-3FLAG-P2A-EGFP由本实验室保存；DMEM高糖培养基购自上海元象生物科技有限公司；胰酶购自上海元象生物科技有限公司；PBS缓冲液购自南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清购自Gbico USA；Lipofectamine TM 3000购自InvitrogenUSA；反转录试剂盒购自Thermo USA；qPCR试剂盒购自近岸蛋白科技有限公司。

表1 RNA-seq样本信息

1.2 方法

1.2.1Tmem176a慢病毒过表达载体的构建及siRNA的设计

通过NCBI找到小鼠Tmem176a的基因编码序列(CDS)，通过同源重组方法将Tmem176a的CDS导入Plenti-CMV-MCS-3FLAG-P2A-EGFP载体、纯化、转化进大肠杆菌、测序。siRNA设计原则：(1)从 mRNA 序列的 AUG 起始密码开始，寻找 AA 二连序列并将其3′端的 19nt 作为潜在的 siRNA 靶点，一般越靠近靶基因 3′端其基因沉默效果可能越出色。(2)序列的GC含量应该为30%～60%。(3)非编码区有丰富的调控蛋白结合区域，会影响 siRNA核酸内切酶复合物结合 mRNA 从而影响基因沉默的效果，因此要避免在此区域内挑选 siRNA。将挑选的序列进行 BLAST 以确保目的序列与其他基因没有同源性。同源重组引物及siRNA设计如表2所示。

表2 同源重组引物及siRNA设计

1.2.2 RNA-seq数据分析

将每种样本细胞按照每孔2×105个细胞的密度接种于24孔板上，待细胞贴壁且培养至80%的汇合度后进行脂质体转染，分别转染进肝癌Hepa1-6细胞48 h后将细胞取出进行RNA抽提，建库，利用Illumina Hiseq测序仪上机测序，测序数据质量评估采用软件FastQC(version 0.10.1)进行分析，对低质量的测序数据过滤采用软件Cutadapt(version1.9.1)，参考序列的比对分析采用软件Hisat2(version 2.0.1)。转录组功能注释采用差异基因表达分析EdgeR(version 3.4.6)、GO enrichment分析Goseq(version 1.34.1)与 GO(Gene ontologyhttp:∥geneontology.org/)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https:∥www.genome.jp/)，与公共数据库中的已知序列进行比对，发现具有较高同源性/相似性的序列。

1.2.3 qPCR验证

采用Thermo Fisher Sicentific公司的First Stand cDNA Synthesis Kit试剂盒，按操作说明进行1 μg RNA逆转录，包括4个过表达Tmem176a后基因B3gnt6、Rab40b、Klhl30、H2-Q2，包括4个敲低Tmem176a后基因Prelid3a、Dipk1b、Cdhrl、Aqp1。使用ddH2O将得到的cDNA进行10倍稀释。按照下列体系进行qPCR检测：10 μL SuperRealPreMix Plus，0.4 μL ROX，2.5 μL cDNA模板，300 nmol/L的上下游引物，补水至20 μL。采用两步法PCR反应程序进行反应：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，62 ℃退火 32 s，40个循环，每个样本做3次重复。结果使用相对定量的方法进行分析，数据以平均值±标准差表示。试验结果使用GraphPad Prism软件，各组间比较采用t检验，P<0.05表示有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 将Tmem176a的过表达载体和siRNA-Tmem176a转染进Hepa1-6细胞中

将Plenti-CMV-Tmem176a-3FLAG-P2A-载体和si-RNA转染进Hepa1-6细胞，72 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光，确定过表达载体转染进Hepa1-6细胞，转染效率约为35%。过表达和敲低Tmem176a后基因相对表达量变化如图1所示。

(a)过表达Tmem176a;(b)敲低Tmem176a。* 表示显著；** 表示较为显著；**** 表示极其显著。

2.2 过表达、敲低Tmem176a后的Hepa1-6细胞RNA-seq结果

2.2.1 过表达、敲低Tmem176a后差异基因的GO分析

使用OmicShare平台GO富集工具进行GO分析，使用R绘制结果如图2所示，这些DEGs生物学过程(biological process，BP)主要参与了生物、脂质代谢过程、氧化还原过程、定位、对脂质转运、脂质代谢过程等。在细胞组分(cellerular component，CC)方面，DEGs富集于质膜成分、细胞表面等。在分子功能(molecular function，MF)方面，DEGs富集于钙离子结合、脂质结合、脂质转运活性、T细胞受体活性、磷脂结合等功能。

(a)OE-Tmem176a;(b)KD-Tmem176a。

2.2.2 过表达、敲低Tmem176a后差异基因的KEGG分析

使用OmicShare平台GO富集工具进行KEGG分析, 使用R 绘制结果如图3所示，这些DEGs生物学过程主要参与了PPAR信号通路、脂肪的消化和吸收、酪氨酸代谢、胆固醇代谢、钙信号通路、蛋白消化和吸收、PI3K-Akt信号通路、胆汁分泌、AMPK通路等。KEGG富集到的与脂质代谢相关的通路较多，表明Tmem176a过表达、敲低后，Hepa1-6细胞脂质代谢通路发生显著性变化。

(a)OE-Tmem176a;(b)KD-Tmem176a。

2.3 聚类分析

为了进一步确认过表达、敲低Tmem176a后差异表达基因，将差异表达基因进行层次聚类分析，筛选依据为每个基因在每组样本间的FPKM值之和≥10、P<0.05，过滤，过表达、敲低Tmem176a后差异表达基因数量分别为322、952，使用R绘制结果如图4所示，可以看到过表达、敲低差异基因可以分为两类。

(a)表示过表达Tmem176a后差异基因热图；(b)表示敲低Tmem176a后差异基因热图。图下方代表样本名称，红色DEGs代表上调的差异基因，蓝色的DEGs代表下调的差异基因,上方分支树为聚类样本，左侧分支树为差异基因聚类，颜色由蓝至红表示基因表达量提高。

2.5 qPCR验证

分别从过表达、敲低的RNA-seq数据结果中随机挑选4个差异基因进行qPCR验证，其中过表达Tmem176a后B3gnt6、Rab40b、H2-Q2、Klhl30变化了0.23、0.41、22.05、30.95倍，敲低Tmem176a后Aqp1、Trac、Prelid3a、Dipk1b变化了0.26、0.38、37.48、36.84倍。与RNA-seq结果进行比较，过表达Tmem176a后B3gnt6、Rab40b、H2-Q2、Klhl30的Fold Change值分别变为-5.48(下调)、-5.18(下调)、4.03(上调)、5.22(上调)，敲低Tmem176a后Aqp1、Trac、Prelid3a、Dipk1b FoldChange值分别变为-5.49(下调)、-5.82(下调)、5.48(上调)、5.50(上调)，qPCR结果如图5所示。qPCR数据与RNA-seq结果变化趋势一致，说明转录组数据可靠。

(a)过表达Tmem176a;(b)敲低Tmem176a。

3 讨论

试验前期通过WGCNA(加权基因共表达网络分析)、QTL(数量性状定位)[7-8]、NGS(二代测序)[9-10]等手段初步鉴定了大量和血脂代谢相关的候选基因，本研究前期利用生物信息学方法分析，从39个候选基因中筛选出Tmem176a作为脂质代谢候选基因。RNA-seq[11-12]数据等结果表明Tmem176a过表达、敲低后会影响细胞内多个基因的表达。这些差异表达基因GO、KEGG、聚类分析结果均显示它们与血脂代谢密切相关，这也恰恰说明Tmem176a可能作为中枢基因来调控复杂的血脂代谢网络。因此，基于以上分析结果，初步认为Tmem176a基因参与血脂代谢的过程且发挥重要的作用，但是具体的分子机制仍需要大量的试验研究。目前，对Tmem176a基因在小鼠层面的研究较少，大多数集中在人类且报道参与了肝癌[13-14]、食道癌、直肠癌、胃癌[15-16]等癌症进展。但是，Tmem176a基因的表达产物是一种跨膜蛋白，为什么会与血脂代谢的阳性基因Srebf2的基因表达谱类似并且参与到血脂代谢，猜测在小鼠中Tmem176a可能作为通道蛋白或是转运蛋白协助脂质小分子进出细胞，也可能像别的跨膜蛋白如LDL受体一样能够与载脂蛋白结合，或如CD36跨膜蛋白一样通过识别脂肪酸从而参与到脂肪酸转运中。

本研究是针对小鼠肝癌细胞模型检测小鼠肝癌细胞基因表达谱，与小鼠正常细胞基因表达谱相比较可能存在差异。在代谢方面，肝癌细胞也和正常细胞存在差异。正常细胞通过新陈代谢的方式，维持正常的生命活动；癌细胞在代谢方面不同于正常的组织细胞，主要表现为蛋白质、核酸等物质的异常旺盛，这样可能使其代谢方式与正常细胞相比较而言出现较大差异。

对细胞表型和动物表型的研究来说，单基因表达水平的变化在体外、体内试验中对血脂水平并不一定会产生显著影响，因此建立与人类血脂代谢相似的细胞模型和动物模型成为试验研究的重点。虽然国内外血脂代谢的研究主要采用高脂小鼠[17]、KO小鼠(Knockout Mouse)[18]及转基因小鼠等，但动物模型周期长和花费大的特点使得其不适合基因的广泛验证。

研究表明，Tmem176a过表达、敲低后都会影响脂质基因表达水平，Tmem176a通过影响脂肪的消化吸收、胆固醇代谢、甘油酯代谢、脂肪酸合成等代谢途径参与到脂质代谢网络中。这一研究结果为脂质代谢候选基因的挖掘提供新的发现，为小鼠脂质代谢理论研究奠定基础。