HPLC波长切换法结合化学计量学对不同厂家四黄止痢颗粒中5种成分的比较分析

张子健，杨楚虹，罗 璇，陈亚军*，徐诗强，汪柱勇，杨 新，李亚威，周 波，刘 洁*，潘源虎，李 硕

(1.武汉科技大学医学院，武汉 430065；2.武汉回盛生物科技股份有限公司，湖北省兽药工程技术研究中心，武汉 430042)

四黄止痢颗粒收载于《中华人民共和国兽药典》2015版二部，由黄芩、黄连、黄柏、大黄、板蓝根、甘草六味中药组成[1]。临床用于治疗禽类、猪由湿热泻痢引起的疾病，如病毒性、细菌性和混合感染引起的猪泻痢，禽大肠杆菌病，鸡白痢，禽伤寒等疾病[2]。但中草药制剂所含成分复杂，且质量标准不完善，加之中草药产地分散，生长环境、采收期、加工炮制工艺不同，以及制剂生产工艺等因素，造成不同厂家生产的同一品种中药产品及同一厂家不同生产批次的产品间存在着质量及临床疗效的差异[3]。目前市场上还存在着非法添加的情况，严重影响了中兽药制剂的质量安全[4]。因此，采用合理有效的方法来保证中兽药制剂的安全、有效、质量可控很有必要。

在《中华人民共和国兽药典》2015版二部中，仅对四黄止痢颗粒中黄芩苷的含量进行定量分析，而单一成分的质量控制难以全面的反应该复方的整体质量。多成分质量控制能全面反应中药复方制剂的整体质量，有助于生产企业和监管部门完善其质量控制标准，以达到产品质量的稳定性[5]。

化学计量学是通过统计学或数学方法在化学体系的测量值与体系状态之间建立联系，在中药质量控制与评价中具有重要意义[6]。模式识别法是化学计量学的重要组成部分[7]，根据有无训练可划分为无监督的模式识别和有监督的模式识别，其中无监督的模式识别方法包括聚类分析、主成分分析等，有监督的模式识别方法包括簇类独立软模式法、判别分析、偏最小二乘法判别分析、人工神经网络等[8]。中药具有化学成分复杂、多成分协同合作等特点，使其分析方法过于复杂，利用化学计量学分析，可使复杂的多指标问题简单化，且结果准确，可解释性强。

在四黄止痢颗粒有关文献的报道中，熊玥等[9]采用HPLC法只检测黄芩苷1个成分；贾纪萍等[10]和王培等[11]分别采用薄层色谱法和HPLC法同时检测黄芩苷和盐酸小檗碱2个成分；郑举等[12]虽然采用HPLC法同时测定大黄素、大黄酸、黄芩苷、甘草酸铵、(R,S)-告依春5个成分，但并没有测定黄连、黄柏药材中共有成分盐酸小檗碱。目前尚未见到同时测定其中(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素5个成分的方法。

为了进一步优化四黄止痢颗粒的质量控制标准，本研究根据“君、臣、佐、使”中医配伍理论，结合中药质量标志物，以君药所含成分为主，兼顾臣佐使药所含成分的确认原则，采用 HPLC法建立一种波长切换法同时测定四黄止痢颗粒中(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素5个指标性成分。同时结合聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等化学计量学方法，评价不同厂家各批次样品之间的质量差异。为四黄止痢颗粒质量的全面控制研究提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(自动进样器，四元泵，柱温箱，VWD检测器)；SQP型电子天平(北京Sartorius科学仪器有限公司)；ME204型电子天平(Mettler Toledo公司)；UPC-III-10T型超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-2700型紫外可见分光光度计(苏州岛津仪器有限公司)。

1.2 试剂 (R,S)-告依春对照品(批号111753-202007，含量100.0%)、黄芩苷对照品(批号110715-201821，含量95.4%)、盐酸小檗碱对照品(批号110713-201814，含量86.7%)、甘草酸铵对照品(批号110731-202021，含量96.2%)大黄素对照品(批号110756-201913，含量96.0%)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈(均为色谱纯)购自Sigma-Aldrich公司；水为UPC-III-10T型超纯水机制备的超纯水；磷酸(批号20190213，分析纯)、冰醋酸(批号20190121，分析纯)、三氟乙酸(批号20160531)均购自国药集团化学试剂有限公司。四黄止痢颗粒由河南省某兽药企业提供(批号20190802、20190805、20190901、20190903、20191002，编号S1～S5)、江西省某兽药企业提供(批号1906901、1906903、1907901、1907904、1908903，编号S6～S10)、天津市某兽药企业提供(批号20190401、20190403、20190502、20190503、20190601，编号S11～S15)湖北省某兽药企业提供(批号20190309、20190410、20190513、20190602、20190703，编号S16～S20)。

2 方法及结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 取(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素对照品各适量，精密称定，加甲醇超声处理(功率250 W，频率40 KHz)使溶解，配制成每1 mL分别含(R,S)-告依春0.7 μg、黄芩苷147.1 μg、盐酸小檗碱35.9 μg、甘草酸铵1.2 μg、大黄素0.05 μg的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取四黄止痢颗粒约10 g，研细。取细粉约1.0 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，密塞，超声处理(功率250 W，频率40 KHz)30 min，放冷至室温，过滤，用10 mL甲醇洗涤锥形瓶和滤纸上的残留物，洗涤3次，合并滤液至100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按照四黄止痢颗粒处方配比，分别制备缺少黄芩、黄连和黄柏、大黄、板蓝根、甘草的阴性样品。将上述阴性样品按“2.1.2”项下方法制备成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件 选用岛津Inertsil ODS-3-C18(4.6mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈(A)-0.3%三氟乙酸水溶液(B)为流动相，按表1程序进行梯度洗脱，流速1 mL·min-1，检测波长245 nm(0～10 min，测定(R,S)-告依春)、278 nm(10～22 min，测定黄芩苷)、266 nm(22～25 min，测定盐酸小檗碱)、249 nm(25～30 min，测定甘草酸铵)、254 nm(30～45 min，测定大黄素)，柱温30 ℃，进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.3 系统适应性试验 取混合对照品溶液按“2.2”项色谱条件进样测定，重复进样6次，取(编号S16)样品，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进样测定。混合对照品溶液和供试品溶液色谱图如图1。结果显示(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素5个指标性成分的保留时间的RSD依次为0.15%、0.11%、0.09%、0.06%、0.08%；峰面积的RSD依次为1.44%、0.24%、0.42%、1.57%、1.39%；各组分峰分离度均大于1.5、对称因子均在0.8～1.2之间、理论塔板数均大于5000。表明系统适应性良好。

图1 混合对照品色谱图(A)及供试品色谱图(B)

2.4 专属性试验 取混合对照品溶液、编号S16的供试品溶液及5种阴性样品溶液，按“2.2”项色谱条件分别进样，验证阴性是否有干扰。5种阴性样品色谱图如图2。结果显示，供试品溶液与混合对照品溶液在相同的保留时间均有各指标性成分的色谱峰，且缺少黄芩的阴性样品溶液中无黄芩苷色谱峰、缺少黄连和黄柏的阴性样品溶液中无盐酸小檗碱色谱峰、缺少板蓝根的阴性样品溶液中无(R,S)-告依春色谱峰、缺少甘草的阴性样品溶液中无甘草酸铵色谱峰、缺少大黄的阴性样品中无大黄素色谱峰。说明四黄止痢颗粒样品中无干扰峰，该方法测定四黄止痢颗粒专属性符合要求。

图2 板蓝根阴性样品色谱图(A)、黄芩阴性样品色谱图(B)、黄连及黄柏阴性样品色谱图(C)、甘草阴性样品色谱图(D)、大黄阴性样品色谱图(E)

2.5 稳定性试验 取同一批样品(编号S16),按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h依次进样。供试品溶液中(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素的保留时间RSD分别为0.1%、0.04%、0.06%、0.06%、0.04%，峰面积RSD分别为1.48%、1.02%、1.12%、1.21%、1.59%。表明四黄止痢颗粒供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 精密度试验 取同一批样品(编号S16)，按“2.1.2”项供试品制备方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下连续进样6次。(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素保留时间的RSD分别为0.14%、0.05%、0.05%、0.02%、0.04%，峰面积的RSD分别为1.28%、0.27%、0.32%、0.84%、1.29%。表明系统精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批样品(编号S16)，按“2.1.2”项供试品制备方法，平行制备6份供试品溶液。按“2.2”项下色谱条件进样测定，根据峰面积计算各待测组分的含量及其RSD值。结果(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素含量的RSD值分别为1.45%、1.01%、1.11%、1.41%、1.62%。表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取样品(编号S16)细粉约1.0 g，共9份，精密称定，分别按80%、100%、120%精密加入5种对照品适量，按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果见表2。(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素的平均回收率分别为102.7%、99.3%、101.1%、98.0%、97.3%，RSD分别为1.56%、0.72%、0.97%、1.33%、1.10%。说明该方法准确度较高。

表2 加样回收率试验(n=3)

2.9 线性与范围考察 将混合对照品溶液分别按10%、40%、60%、80%、100%逐级稀释，得到系列质量浓度混合对照品溶液,样品(编号S16)中各成分的含量均为混合对照品的60%。按“2.2”项色谱条件，进样测定，记录色谱图。以进样浓度(X，μg·μL-1)为横坐标/峰面积(Y)为纵坐标，绘制5个组分的标准曲线，进行线性回归，计算回归方程和相关系数，结果表明5个成分在设定的线性范围内线性关系良好。将混合对照品溶液用甲醇逐步稀释，以信噪比(S/N)约为10时的混合对照品溶液浓度为定量限(LOQ)。标准曲线、线性范围、相关系数及定量限结果见表3。

表3 线性关系考察

2.10 样品含量测定 取20批样品，每一批样品平行取三份，按“2.1.2”项的方法制成供试品溶液，按“2.2”项色谱条件进样测定，计算(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素的含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果(n=3)

3 化学计量学分析

3.1 聚类分析(CA) 聚类分析是一种通过数据建模简化数据的方法，根据研究对象的某些特征加以分类，建立样本间的相似关系，现已广泛应用于中药及其制剂的质量评价中[13]。以20批不同厂家不同批次的四黄止痢颗粒中5个指标性成分的含量为变量，采用SPSS 26.0软件组间联接系统聚类法，以Euclidean距离为测度进行聚类分析，结果见图3。当类间距为5时，20批样品可分为4类，S16、S19、S17、S18、S20为第Ⅰ类；S11、S15、S13、S14、S12为第Ⅱ类；S3、S5、S4、S2、S1为第Ⅲ类；S6、S7、S10、S9、S8为第Ⅳ类。当类间距为15时，20批样品可分为2类，上述Ⅰ、Ⅱ类聚为一类，Ⅲ、Ⅳ类聚为一类。表明四黄止痢颗粒中5种指标性成分的含量与生产厂家有关，造成明显聚类的原因可能与不同厂家生产时所用的原药材质量差异以及生产工艺差异有关。

图3 20批四黄止痢颗粒样品聚类树状图

3.2 Hotelling’s T2 和DModX控制限的建立 Hotelling’s T2 和DModX控制图是2个互补的多变量分析手段，用于监测不同批次的产品质量[14]。Hotelling’s T2表示的是每个选定观察点与模型平面中原点的距离，为模型的内部变化量，代表样品与主成分模型中其他样品的差异；DModX表示数据在变量X空间到主成分模型的距离，代表样品中未被模型解释的变化。通常认为在控制限以下的产品为正常批次产品。Hotelling’s T2 和DModX统计量作为批次间差异性评价指标，两者具有不同的监控作用，互为补充[15]。

Hotelling’s T2 和DModX的控制图如图4、图5，图中的T2Crit(99%)和DCrit为控制限，其控制上限分别为17.385和0.05；T2Crit(95%)为警戒限，上限为10.7186。这20批样品均在控制限以下，均为正常批次产品。

图4 20批四黄止痢颗粒样品Hotelling’s T2控制图

图5 20批四黄止痢颗粒样品DModX控制图

3.3 偏最小二乘判别分析(PLS-DA) 偏最小二乘判别分析是一种通用算法，可用于预测和描述性建模以及判别变量选择[16]。同时，也是一种监督算法，是化学计量学中常用于特征提取和判别分析的技术[17]。为评价不同厂家不同批次四黄止痢颗粒样品间的差异，采用PLS-DA模型进行分析。以5种指标性成分的含量为X变量，以样品S1～S20为Y变量，利用SIMCA 13.0软件进行PLS-DA处理，结果见图6、图7。发现在置信区间95%内，20批样品存在一定差异性，根据分布可将20批样品分为4类，样品S1～S5为一类；S6～S10为一类；S11～S15为一类；S16～S20为一类，与聚类分析结果一致。表明这5种指标性成分在评价不同厂家的产品质量上具有重要参考价值。在PLS-DA模型中，某一成分的变量重要性投影(VIP)越大，表示这一成分对样品分类的贡献度越大[18]。其中VIP值>1的有3种成分，分别为小檗碱、(R,S)-告依春和大黄素，说明这三种成分是影响不同厂家样品之间质量差异贡献较大的成分。

图6 20批四黄止痢颗粒样品PLS-DA得分图

图7 四黄止痢颗粒中5种成分的VIP值

4 讨论与结论

4.1 指标成分的选择 《中华人民共和国兽药典》2015版二部中收录的四黄止痢颗粒，只对其中的黄芩苷进行含量测定。郑举等虽然测定了大黄素等5个成分，但并没有对小檗碱进行含量测定。小檗碱作为黄连、黄柏药材中共有的指标性成分，有必要对主成分小檗碱进行质量研究。本实验同时选定四黄止痢颗粒处方中每一味药材的指标性成分作为质量研究对象，更加严谨的评价四黄止痢颗粒的质量。

4.2 流动相的选择 本实验比较了多种流动相系统。有机相比较了甲醇和乙腈，水相比较了磷酸水溶液、冰醋酸水溶液和三氟乙酸水溶液。分别采用甲醇-0.05%磷酸水溶液、甲醇-0.5%冰醋酸水溶液、甲醇-0.3%三氟乙酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.5%冰醋酸水溶液、乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液。结果表明，在乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液的流动相中，各指标成分色谱峰的分布、峰形和分离度均良好。因此，选择乙腈-0.3%三氟乙酸水溶液作为四黄止痢颗粒含量测定的流动相。

4.3 检测波长的选择 本实验使用紫外可见分光光度计在190～400 nm范围内对5个指标性成分进行全波长扫描，结果显示(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素分别在244.5、277.5、229.5、248.5、221 nm处存在最大吸收，5个指标性成分的最大吸收波长存在较大差异，难以实现同一波长下同时检测5种指标成分。最终选择分段波长切换法测定5个指标成分的含量。

4.4 结果分析 本研究利用HPLC波长切换法测定了四黄止痢颗粒中5种指标性成分的含量，并在此基础上首次结合化学计量学方法对不同厂家不同批次的四黄止痢颗粒进行了差异分析。在PCA模型的基础上设定了Hotelling’s T2 和DModX控制限，对不同厂家不同批次的产品进行了监测，4个厂家的20批样品均为正常批次样品。通过聚类分析及PLS-DA得分图可以看出，同一厂家生产的不同批次的样品质量一致性较好，但不同厂家之间样品的质量一致性存在明显差异。不同厂家的样品差异在指标性成分的含量上体现出来，进一步通过PLS-DA中的VIP值可以判断出，小檗碱、(R,S)-告依春和大黄素是造成明显差异的主要原因。以上3种成分的差异可能与不同厂家的生产工艺及设备有关，也可能与各厂家所使用的黄连、黄柏、大黄和板蓝根药材的产地、采收条件及炮制方法等因素有关。提示生产企业关注所用原药材的质量控制，加强原药材内控质量标准的管理，优化生产过程中的工艺及设备参数，确保产品质量与临床疗效的一致性。

4.5 结论 中兽药制剂成分复杂，而中兽药复方制剂发挥疗效，不是一种或一类成分的作用，也不是所有有效成分药效作用的简单加和，是多组分作用于机体的综合效应。单一的化学分析评价方法不能充分判断中兽药质量的一致性[19]。对于企业来说，多成分含量测定不仅可以作为企业的内控标准，用于产品的批次间质量一致性评价研究，也可反映一段时期内用于生产的原料药材的质量变化，有助于进一步固定产地、厂家等，对更好的控制和保证药品质量具有重要意义；且多成分含量测定还可以用于不同企业之间药品质量的横向对比研究[20]。

实验建立了HPLC波长切换法同时测定四黄止痢颗粒中(R,S)-告依春、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、大黄素5种成分的分析方法。相较于药典与文献已有报道的方法，增加了检测指标，且检测药材更全面，对四黄止痢复方中6味药材的指标性成分都进行了检测。并首次结合化学计量学对20批不同厂家不同批次的样品进行分析，发现了不同厂家之间产品质量有明显差异及造成差异的3种成分。该方法简便快速，准确度高，重复性好，可更全面的控制四黄止痢颗粒的质量，为四黄止痢颗粒的质量评价提供了依据。