蛋氨酸负荷对去卵巢大鼠氧化应激的改变及叶酸对其的影响

田盼丽，尚 涛，李红梅

近年血浆同型半胱氨酸(Hcy)的研究受到广泛关注。多项研究表明血浆同型半胱氨酸水平升高可引起冠心病等动脉粥样硬化性心脑血管疾病，但其中发病机制尚未明确。我们研究在大鼠去势后，血浆同型半胱氨酸水平升高是否可通过氧化应激途径发挥致动脉粥样硬化作用效应及叶酸治疗是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料：FA (folic acid,上海玉博生物科技有限公司)，FA纯度>99%；Hcy ELISA 试剂盒：上海玉博生物科技有限公司，批号为CSB-E08896r；TAC、GSH-Px及MDA试剂盒:南京建成生物工程研究所产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及模型建立：于兰州大学医学院购买健康SD大鼠32只，均为4月龄雌性鼠，体重220～260 g。在无菌条件下，OVX组、MET组、FA组实验大鼠被给予戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔注射麻醉后，双侧卵巢通过下腹正中切口被切除，以上3组的输卵管及卵巢伴行血管被结扎，冲洗闭合伤口。其余8只保留卵巢，只切除相同大小的卵巢周围脂肪组织，作为SHAM组。

1.2.2 分组及处理：①假手术组(SHAM组);②去势组(OVX组);③蛋氨酸负荷组(MET组)：大鼠摘除卵巢后一周，使用蛋氨酸1 mg/(kg·d)灌胃;④叶酸治疗组(FA组)：去卵巢+蛋氨酸灌胃，给予叶酸20 mg/(kg·d)腹腔注射。去势1周后，SHAM、OVX组给予蒸馏水灌胃，剩余2组给予蛋氨酸灌胃，FA组给予叶酸干预治疗，共持续9周。

1.2.3 血清同型半胱氨酸测定：以上干预10周后行腹主动脉穿刺取血，分离血清，-20 ℃保存，采用酶联免疫吸附法测定。本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中同型半胱氨酸水平。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD)，计算样品浓度，按照试剂盒的说明书具体操作。

1.2.4 血清氧化应激指标测定均按照试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 大鼠血清Hcy水平：与SHAM组比较，OVX组血清同型半胱氨酸浓度显著升高(P<0.05)；给予蛋氨酸灌胃，MET组的Hcy浓度进一步升高(P<0.05)；叶酸治疗可显著降低血清Hcy浓度(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清Hcy水平

2.2 各组大鼠血清TAC、GSH-Px和MDA的变化：与SHAM组相比，OVX组血清TAC、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)，MDA浓度明显升高(P<0.05)；给予蛋氨酸负荷，MET组血清TAC、GSH-Px活性进一步降低(P<0.05)，而MDA浓度进一步升高，叶酸治疗可增强TAC、GSH-Px活性，降低MDA浓度(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清TAC、GSH-Px、MDA浓度的比较

3 讨论

女性进入更年期后，血浆雌二醇水平下降的同时，也会出现高同型半胱氨酸血症(HHcy)[1-2]。大鼠去卵巢后给予蛋氨酸负荷，蛋氨酸在体内通过腺苷转移酶及甲基转移酶等作用代谢为同型半胱氨酸而使血浆中同型半胱氨酸水平进一步升高[3]。近年来发现HHcy是心血管疾病的独立危险因素，可致动脉粥样硬化[4-5]。该实验结果表明，摘除卵巢后雌性大鼠的血浆Hcy浓度升高，去卵巢大鼠给予蛋氨酸负荷9周，可充分诱导高同型半胱氨酸血症。

抗氧化与促氧化之间的失衡可引起氧化应激。TAC及GSH-Px是抗氧化的指标，前者反映机体总的抗氧化能力；后者可以使氧化型谷胱甘肽转变为还原型谷胱甘肽；MDA是氧化应激的产物，其水平上升说明脂质过氧化作用增强。HHcy等因素可降低机体抗氧化作用，促进氧化反应的发生，损伤全身多处组织细胞[6]，通过多种途径促进炎症反应的发生，并可抑制细胞内的正常信号传导及加快细胞的死亡和凋亡等。有实验表明[7]同型半胱氨酸可降低细胞内GSH-Px的浓度，增强脂质过氧化物与H2O2的细胞损伤效应。目前认为[7]Hcy可能通过以下途径诱导ROS生成：①Hcy结构中的巯基活性较强，可氧化产生H2O2和O2-；②Hcy可能通过线粒体途径、NADPH氧化酶途径促进活性氧生成；③Hcy降低超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化酶的数量和活性。本实验发现，大鼠去卵巢后抗氧化指标总抗氧化力、谷胱甘肽过氧化酶下降，而丙二醛升高，即去卵巢本身即可导致机体氧化应激的发生。切除卵巢的大鼠再给予蛋氨酸负荷后，血清总抗氧化力、过氧化酶谷胱甘肽的水平进一步下降，而丙二醛进一步升高，说明蛋氨酸负荷加重了去卵巢大鼠的氧化应激损伤。经相关分析表明，大鼠血清同型半胱氨酸浓度与抗氧化物血清总抗氧化力、谷胱甘肽过氧化酶呈显著负相关，与丙二醛呈显著正相关。近年来，叶酸的研究及临床使用受到了广泛的关注，其作为一种新型的抗氧化剂，在显著降低血浆Hcy水平的同时，也改善了机体的氧化应激损伤。本实验结果表明，与MET组大鼠比较，叶酸可显著升高TAC、GSH-Px水平，显著降低MDA水平，增强抗氧化体系能力，具有抗氧化作用。这与国内学者蒋兴亮等[8]发现血浆同型半胱氨酸水平升高的患者中，其超氧化物歧化酶水平低于正常对照组，血浆丙二醛水平则明显高于正常对照组的结论一致。

综上所述，本研究观察了去势大鼠给予蛋氨酸负荷后，血浆同型半胱氨酸及氧化应激标志物水平的改变以及给予抗氧化剂叶酸后上述指标的改变。结果表明去卵巢大鼠经蛋氨酸负荷后血浆Hcy水平及氧化产物升高，抗氧化能力下降，叶酸可逆转高同型半胱氨酸症引起的氧化应激损伤。同时也证明了去卵巢大鼠动脉粥样硬化发生进展中有氧化应激的参与，故叶酸作为一种新型抗氧化剂可能为动脉粥样硬化的防治提供了一个新思路。