两种品牌血培养瓶抗生素吸附能力对比研究

王萌 周义正 罗金柱 李承彬★ 龚权

血流感染的患病率高，如果不能及时治疗将导致严重后果，血培养是血流感染诊断的金标准［1］。为提高血流感染的检出率，通过体外模拟菌血症环境进行对比实验以选择性能较佳的血培养瓶逐渐成为热门方法临床上送检的血液标本大多含有一定浓度抗生素，因此不同厂家都在原培养瓶的基础上提高抗生素吸附性能［2⁃3］。由于含有的介质不同，不同血培养瓶所具有的抗生素吸附能力也有所不同。近年来，国外已有关于梅里埃与BD 树脂瓶进行比较的文献研究［4⁃9］。然而国内对在我国新上市的BacT/Alert 树脂血培养瓶抗生素吸附能力的研究鲜有报道。因此，本研究通过体外模拟实验比较法国梅里埃BacT/Alert 树脂血培养瓶与美国BD Bactec 树脂需氧瓶和溶血素厌氧瓶的抗生素吸附能力，为临床上选择性能较佳的诊断工具提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

法国梅里埃BacT/Alert 树脂血培养瓶与美国BD Bactec 树脂需氧瓶和溶血素厌氧瓶。

1.2 仪器与试剂

BACTEC FX 400 型号血培养系统（美国BD公司）及其配套的Bactec 树脂需氧瓶、溶血素厌氧瓶（以下简称为BD⁃FA，BD⁃FN 瓶），Bact/Alert 3D 240 型号血培养系统（法国梅里埃公司）及其配套BacT/Alert 树脂需氧和树脂厌氧瓶、无抗生素吸附物质的标准需氧瓶和厌氧瓶（以下简称为BMX⁃FA，BMX⁃FN、BMX⁃SA、BMX⁃SN 瓶），血培养瓶均在有效期内，BD⁃FA 批号：0217225；BD⁃FN 批号：0217236；BMX⁃FA 批号：4100080；BMX⁃FN 批号：4056920；BMX⁃SA 批号：105516；BMX⁃SA 批号：1056750。标准菌株：大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC29213，肺炎链球菌ATCC49619，脆弱拟杆菌ATCC25285，光滑念珠菌ATCC90030（来源于美国模式培养物集存库，ATCC）。实验所用抗生素品种包括亚胺培南、万古霉素、氨苄西林、头孢曲松、甲硝唑、美罗培南、米卡芬净（均来自于大连美仑生物技术有限公司）。磷酸盐缓冲溶液（蒙博生物科技有限公司），无菌羊血（北京奥科赛德生物技术有限公司）。

1.3 方法

通过查阅临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100、抗微生物治疗指南2018 版（热病）、临床微生物检验程序验证指南2018 版（CNAS⁃GL028）等相关文献［10⁃12］，设计临床正在使用的常规抗生素及特殊抗生素的实验组合。阳性对照组：加入无菌羊血和菌悬液，每种类型血瓶3 个重复；阴性对照组：BMX⁃SA 瓶加入无菌羊血和抗生素溶液，每种抗生素3 个重复；实验组：加入无菌羊血、菌悬液和抗生素溶液，每种类型血瓶5 个重复。根据CLSI M100 的指南使用合适的溶剂和稀释剂，亚胺培南采用无菌的磷酸盐缓冲液作为溶剂和稀释剂，其他抗生素采用无菌蒸馏水作为溶剂和稀释剂。根据热病制备每种抗生素最高血药浓度（PSL），亚胺培南为40 μg/mL、万古霉素50 μg/mL、氨苄西林100 μg/mL、头孢曲松150 μg/mL、美罗培南49 μg/mL、米卡芬净10 μg/mL、甲硝唑25 μg/mL 等，预试验时发现甲硝唑10%PSL 才能得出阳性结果，因此本次实验甲硝唑浓度配置为2.5 μg/mL。标准菌株传代两次，培养18 h～24 h，制备0.5 麦氏浓度的菌悬液，然后用生理盐水倍比稀释，制备终浓度为102CFU/mL 的菌悬液，根据CNAS⁃GL028 要求最终加入血培养瓶的细菌浓度为5～30 CFU/瓶，需添加适量的新鲜无菌血液（成人瓶5～10 mL，儿童瓶1～3 mL），因此本实验中每瓶加入0.3 mL 菌悬液，9 mL 无菌新鲜羊血模拟人体正常采血。根据每种抗生素标准品中附带的说明书和CLSI M100 中制备抗生素溶液的步骤，制备最终加入量为0.5 mL 的抗生素溶液备用。首先采用75%酒精消毒瓶口，加入9 mL 无菌新鲜羊血，按不同分组加入0.3 mL 制备好的菌悬液，0.5 mL 抗生素溶液或生理盐水，颠倒混匀，尽快放入血培养仪器中孵育，记录不同血培养瓶五天内的阳性报警情况及检出时间（time to detection，TTD）。阴性判断标准：五天内未报阳性且转种培养结果为阴性的血培养瓶判定为阴性瓶；阳性判断标准：五天内报阳性，转种培养结果为阳性，质谱仪鉴定结果验证为加入菌种的血培养瓶判定为阳性瓶［13］。

1.4 统计学分析

应用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析；不同培养瓶对细菌的TTD，样本呈正态分布，采用（±s）表示，两组数据之间的比较采用t检验的方法；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同需氧瓶细菌TTD 比较

阳性对照组均报阳，检出率均为100%（3/3），阴性对照组均报阴，抗生素有效。在加入抗生素的需氧瓶实验组中，含氨苄西林的大肠埃希菌组，BD⁃FA 与BMX⁃FA 瓶检出率相同，均为100%（5/5）。BMX⁃FA 瓶TTD 较BD⁃FA 瓶长，差异有统计学意义（P<0.05）。含亚胺培南的大肠埃希菌及含头孢曲松的大肠埃希菌和肺炎链球菌中，两种品牌需氧瓶均未检出。含万古霉素的金黄色葡萄球菌中，BD⁃FA 比BMX⁃FA 瓶的检出率低，分别为40%（2/5）和100%（5/5）且BD⁃FA 瓶的检出时间更长（P<0.05）；含米卡芬净的光滑念珠菌中，BD⁃FA比BMX⁃FA 瓶的检出率低，分别为60%（3/5）和100%（5/5）且BD⁃FA 瓶检出时间更长，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 菌液浓度102 CFU/mL 包含抗菌药物的需氧瓶检出率和检出时间（±s）Table 1 The detection rate and detection time of aerobic bottles containing antibacterial drugs with a bacterial concentration of 102 CFU/mL（±s）

表1 菌液浓度102 CFU/mL 包含抗菌药物的需氧瓶检出率和检出时间（±s）Table 1 The detection rate and detection time of aerobic bottles containing antibacterial drugs with a bacterial concentration of 102 CFU/mL（±s）

注：NG 表示未出现阳性结果。

标准菌株t 值P 值大肠埃希菌ATCC25922 2.59 0.03金黄色葡萄球菌ATCC29213肺炎链球菌ATCC49619光滑念珠菌ATCC90030抗菌药物亚胺培南氨苄西林头孢曲松万古霉素头孢曲松米卡芬净药物浓度（μg/mL）40 100 150 50 150 10检出率（%）BMX⁃FA NG 100（5/5）NG 100（5/5）NG 100（5/5）BD⁃FA NG 100（5/5）NG 80（4/5）NG 60（3/5）检出时间（h）BMX⁃FA NG 11.04±0.24 NG 15.70±0.76 NG 61.06±10.42 BD⁃FA NG 10.45±0.45 NG 21.50±0.71 NG 94.20±1.74 12.49<0.01 7.01<0.01

2.2 不同厌氧瓶的细菌检出时间

两种品牌的厌氧瓶阳性对照组均报阳，检出率均为100%（3/3），每种抗生素的阴性对照组均报阴，抗生素有效。含亚胺培南、万古霉素、氨苄西林、甲硝唑、美罗培南抗生素的BD⁃FN 瓶均未出现阳性结果，而BMX⁃FN 检出率均为100%（5/5）。含头孢曲松的大肠埃希菌和肺炎链球菌的两种品牌血培养瓶均未获得阳性结果。见表2。

表2 菌液浓度102 CFU/mL 包含抗菌药物的厌氧瓶检出率和检出时间（±s）Table 2 The detection rate and detection time of anaerobic bottles containing antibiotics at a concentration of 102 CFU/mL（±s）

表2 菌液浓度102 CFU/mL 包含抗菌药物的厌氧瓶检出率和检出时间（±s）Table 2 The detection rate and detection time of anaerobic bottles containing antibiotics at a concentration of 102 CFU/mL（±s）

注：NG 表示未出现阳性结果。

标准菌株检出率（%）大肠埃希菌ATCC25922金黄色葡萄球菌ATCC29213肺炎链球菌ATCC49619脆弱拟杆菌ATCC25285抗菌药物亚胺培南氨苄西林头孢曲松万古霉素头孢曲松甲硝唑美罗培南药物浓度（μg/mL）40 100 150 50 150 2.5 49 BMX⁃FN 100（5/5）100（5/5）NG 100（5/5）NG 100（5/5）100（5/5）BD⁃FN NG NG NG NG NG NG NG检出时间（h）BMX⁃FN 12.38±0.22 10.45±0.45 NG 16.50±1.84 NG 70.70±8.03 45.70±1.96 BD⁃FN NG NG NG NG NG NG NG

3 讨论

近年来随着抗生素的广泛使用，采血时患者往往正在接受抗生素治疗，这些抗生素可能抑制细菌的检出，通过对抗生素使用前后血培养的研究证实使用抗生素之后的培养不太可能会检出微生物［14］。目前我国各大医院使用的进口血培养瓶多来源于美国BD 与法国生物梅里埃公司。为了能帮助临床选择合适的血培养瓶，本研究模拟菌血症环境进行对比实验，研究两种品牌含树脂的血培养瓶的抗生素吸附能力。本次实验结果表明，BMX⁃FA 瓶的抗生素吸附能力总体上比BD⁃FA瓶更好，特别是在万古霉素和米卡芬净组中，主要原因是法国梅里埃更新了树脂的材质，采用APB（聚合物吸附珠），它拥有更大的接触表面积，抗生素的吸附能力和吸附速率更好［9］。碳青霉烯类抗生素的吸附能力是梅里埃专利技术，需要严格的厌氧环境，血瓶中的半胱氨酸共价键才能有效破坏碳青霉烯类抗生素的活性［9］。因此在亚胺培南抗生素组中，只有BMX⁃FN 瓶报阳，而梅里埃需氧瓶BMX⁃FA 瓶未报阳，也证明了临床上同时采集厌、需氧瓶进行培养的重要性。虽然BD⁃FN 瓶中含有洗涤剂皂甙用于白细胞裂解以利于细胞内外细菌的生长，但是其不含任何抗生素吸附剂功能［15］，本次实验中BD⁃FN 瓶出现了全部阴性的结果，显示出BD⁃FN 瓶无抗生素吸附能力。因此，对于已经使用抗生素后再采集血培养的患者，应该慎重选择BD⁃FN 瓶。本次实验中含有头孢曲松药物的血培养瓶均未有细菌生长，这与Dieter Mittereg⁃ger 等［2］和Giulia Menchinelli 等［8］研究结果类似，说明目前两种品牌的树脂瓶对头孢曲松的吸附能力尚不足，也是研究者们未来研发的方向。

综上所述，临床使用碳青霉烯类、万古霉素和米卡芬净等抗生素时，尽量使用BMX⁃FA/FN 瓶采集血培养来提高阳性率和缩短TTD；怀疑患者厌氧菌感染时，在已使用甲硝唑和美罗培南抗生素治疗的情况下，尽量不要选择可能无抗生素吸附能力的BD⁃FN 瓶采集血培养。由于时间和成本限制，BD⁃FN 瓶有无抗生素吸附能力有待于进一步研究。另外，头孢曲松的阴性结果表明继续进行该类研究的必要性，从而为患者选择更优的血培养瓶以进行及时的治疗。同时提醒临床上，提高病原菌的检出率，在抗生素应用之前对患者进行血培养标本采集的重要性。为了应对病原菌的性状变化，未来该类实验将在模拟实验的基础上以病人血培养开展大量的临床实验，将更能体现不同树脂的检测能力与抗生素吸附能力，为临床上提供更省时与可靠的工具。