弥漫性大B细胞淋巴瘤中miR⁃34a、FOXP1表达的相关性及临床意义

陈思言 杨丽华 张伶莉 董事 李亚琼 龚吉昌 罗河 魏中华 李先莉

弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B⁃cell lymphoma，DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型，具有高度异质性和侵袭性［1⁃2］，发病机制至今未完全阐明。近些年，微小RNA（microRNA，miR）在血液系统恶性肿瘤发病中的作用受到越来越多关注，miR 通过靶向调控抑癌基因或原癌基因的方式起到促癌或抑癌作用。MiR⁃34a 是一种具有抑癌作用的miR，相关的临床研究证实miR⁃34a 在DLBCL［3］、急性髓细胞白血病［4］、慢性淋巴细胞性白血病［5］患者中表达降低，但miR⁃34a 在DLBCL发病过程中表达变化的临床意义及生物学意义尚不清楚。武君的细胞实验研究证实，miR⁃34a 对DLBCL 细胞凋亡具有促进作用，靶向抑制原癌基因叉头框蛋白P1（forkhead box protein 1，FOXP1）是miR⁃34a 发挥促凋亡作用的分子机制［6］。本研究将以DLBCL 患者为对象，探究DLBCL 中miR⁃34a、FOXP1 表达的相关性及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016年2月至2019年7月在达州市中心医院血液内科诊断为DLBCL 的70 例患者，另取同期经病理确诊为反应性增生淋巴结组织的80例患者作为对照。DLBCL 患者中男性51 例、女性29 例，年龄平均（52.32±10.37）岁；反应性淋巴结增生患者中男性36 例、女性24 例，年龄平均（49.95±10.75）岁。DLBCL 患者与反应性淋巴结增生患者一般资料的比较，差异无统计学意义（P>0.05）。所有患者及家属均知情同意，本实验经医院伦理委员会批准。

纳入指标：①经病理学确诊为DLBCL［7］；②未接受过任何放化疗；③临床病理资料完整。排除标准：①中枢神经系统、血管、纵膈大B 细胞淋巴瘤；②合并或既往有其他恶性肿瘤；③合并自身免疫性疾病、急慢性感染。

1.2 研究方法

1.2.1 miR⁃34a 表达水平的检测

取DLBCL 组织与反应性增生淋巴结组织，采用北京天根生化公司的试剂盒进行实验。首先提取组织中的miR，而后反转录合成cDNA，配置荧光定量PCR 反应体系对cDNA 进行扩增，反应体系如下：体系：cDNA 1 μL、反应混合液10 μL、正向引物和反向引物各0.5 μL、去离子水补足体系至20 μL，分别使用目的基因miR⁃34a 引物（上游序列：5′⁃TAGCGATTATGCTAGCTAG⁃3′，下游序列为试剂盒内的通用引物序列）及内参基因U6 引物（上游序列：5′⁃TATCGTTAGTAGCTAGCTAG⁃3′，下游序列：5′⁃TAGCTATTAGCTAGCTAGA⁃3′）。在PCR仪（美国Bio⁃rad 公司）上设置反应程序为：95℃预变性3 min、95℃15 s 及60℃34 s 重复40 个循环，得到miR⁃34a 及U6 的循环曲线，以U6 为内参、按照公式2⁃△△Ct计算miR⁃34a 的表达水平。

1.2.2 FOXP1 表达水平的检测

取DLBCL 组织与反应性增生淋巴结组织，加入组织裂解液（上海碧云天公司）提取组织蛋白，检测蛋白浓度后取20 μg 蛋白进行western blot检测，进行电泳分离不同分子量的蛋白，电转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭PVDF 膜1 h，1∶1 000 稀释的FOXP1 一抗（Abcam 公司）及1∶5 000 稀释的β⁃actin 一抗（Sigma 公司）4℃孵育PVDF 膜过夜，次日1∶1 000 稀释的二抗孵育PVDF 膜1h，最后显影得到蛋白条带，以β⁃actin 的条带灰度值为内参，计算FOXP1 的表达水平。

1.2.3 在线生物信息学分析

在TargetScan 网站进行生物信息学分析，输入FOXP1基因信息，分析FOXP1基因mRNA 3′UTR中与miR⁃34a 互补配对结合的碱基位点。

1.2.4 预后随访

采用门诊复查、电话回访等方式进行随访，随访截止日期2020年12月31日，随访内容为疾病进展，记录无进展生存情况。

1.2.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件及Prism6.0 软件进行统计学分析及制图，计量资料以均（±s）表示，两组间比较采用t检验；无进展生存率以K⁃M 曲线描述，两组间无进展生存率比较采用Log⁃rank 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL 组织与反应性增生淋巴结组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的比较

DLBCL 组织中miR⁃34a 的表达水平低于反应性增生淋巴结组织，FOXP1 的表达水平高于反应性增生淋巴结组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

表1 DLBCL 组织与反应性增生淋巴结组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的比较（±s）Table1 comparison of miR⁃34⁃a and FOXP1 expression in DLBCL and reactive proliferative lymph nodes（±s）

表1 DLBCL 组织与反应性增生淋巴结组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的比较（±s）Table1 comparison of miR⁃34⁃a and FOXP1 expression in DLBCL and reactive proliferative lymph nodes（±s）

组织来源DLBCL 组织反应性增生淋巴结组织t 值P 值n 70 60 miR⁃34a 0.71±0.20 1.00±0.26 7.179 0.000 FOXP1 1.22±0.30 0.59±0.12 15.248 0.000

图1 Western blot 检测Figure 1 Detected by western blot

2.2 DLBCL 组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的相关性

经在线生物信息学分析，FOXP1基因mRNA 3′UTR 中含有miR⁃34a 的结合序列；经Pearson 检验，DLBCL 组织中miR⁃34a 表达水平与FOXP1 表达水平具有负相关关系（r=-0.528、P=0.000）。见图2。

图2 DLBCL 组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的相关性Figure 2 Correlation of miR⁃34a and FOXP1 expression levels in DLBCL

2.3 不同临床病理特征DLBCL 组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的比较

不同性别、年龄的DLBCL 组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的比较，差异无统计学意义（P>0.05）；临床分期Ⅲ～Ⅳ期、LDH 升高、IPI 评分≥2 分、Nom⁃GCB 亚型DLBCL 组织中miR⁃34a 的表达水平低于临床分期Ⅰ～Ⅱ期、LDH 正常、IPI 评分0～1分、GCB 亚型DLBCL 组织，FOXP1 的表达水平高于临床分期Ⅰ～Ⅱ期、LDH 正常、IPI 评分0～1 分、GCB 亚型DLBCL 组织，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征DLBCL 组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的比较（±s）Table 2 Comparison of miR⁃34a and FOXP1 expression levels in DLBCL tissues with different clinicopathological characteristics（±s）

表2 不同临床病理特征DLBCL 组织中miR⁃34a、FOXP1 表达水平的比较（±s）Table 2 Comparison of miR⁃34a and FOXP1 expression levels in DLBCL tissues with different clinicopathological characteristics（±s）

项目性别n男女t 值0.966 P 值0.337 t 值0.675 P 值0.501年龄0.900 0.372 0.855 0.396临床分期3.109 0.003 3.069 0.003 LDH 3.179 0.002 4.493 0.000 IPI 评分3.282 0.002 3.144 0.002 Hans 分型≤60 岁>60 岁Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ正常升高0～1≥2 GGB 亚型Non⁃GGB 亚型45 25 22 48 30 40 19 51 38 32 25 45 miR⁃34a 0.69±0.18 0.74±0.25 0.74±0.28 0.69±0.18 0.79±0.26 0.63±0.18 0.82±0.28 0.65±0.16 0.79±0.25 0.61±0.20 0.80±0.26 0.62±0.16 3.589 0.001 FOXP1 1.24±0.27 1.19±0.34 1.27±0.39 1.20±0.28 1.07±0.34 1.29±0.26 0.91±0.39 1.28±0.27 1.08±0.34 1.32±0.29 1.02±0.34 1.31±0.29 3.767 0.001

2.4 不同miR⁃34a 表达水平DLBCL 患者预后的比较

DLBLC 组织中miR⁃34a 表达水平的中位数为0.723 5，miR⁃34a 表达水平≥0.723 5 的DLBCL患者无进展生存时间较miR⁃34a 表达水平<0.7235 的DLBCL 患者延长，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

图3 不同miR⁃34a 表达水平DLBCL 患者无进展生存的K⁃M 侵袭Figure 3 K⁃M curve of progression free survival in DLBCL patients with different miR⁃34a expression levels

2.5 不同FOXP1表达水平DLBCL患者预后的比较

DLBLC 组织中miR⁃34a 表达水平的中位数为1.21，FOXP1 表达水平≥1.21 的DLBCL 患者无进展生存时间较FOXP1 表达水平<1.21 的DLBCL患者缩短，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

图4 不同FOXP1 表达水平DLBCL 患者无进展生存的K⁃M 曲线Figure 4 K⁃M curve of progression free survival in DLBCL patients with different FOXP1 expression levels

3 讨论

DLBCL 具有高度异质性和侵袭性，发病机制未完全阐明，原癌基因激活、抑癌基因失活可能与疾病的发生有关，探究DLBCL 发病过程中原癌基因及抑癌基因的调控机制有助于深入认识疾病的发病机制。miRs 是一类长度18⁃25nt 的非编码RNA，具有广泛的生物学作用，能够在转录后水平负调控基因表达，多种原癌基因、抑癌基因的表达均受到miRs 调控。因此，miRs 成为了近些年研究恶性肿瘤发病机制的热门分子。

miR⁃34a 是一种具有抑癌作用的miR，Chou KY［8］、Li HL［9］、Dong B［10］、Xu XP［11］的研究分别在膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞中证实过表达miR⁃34a对癌细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为具有抑制作用。在血液系统恶性肿瘤的发病过程中，Balatti V［4］、Huang Y［5］的研究分别在急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病患者中检测到miR⁃34a 表达降低，表明miR⁃34a 的低表达参与血液系统恶性肿瘤的发病。武君的研究通过细胞实验证实miR⁃34a 对DLBCL 细胞凋亡具有促进作用［6］，本研究在此基础上检测了DLBCL 组织中miR⁃34a 表达的变化，与反应性增生淋巴结组织比较，DLBCL组织中miR⁃34a 的表达明显降低，与miR⁃34a 在其他血液系统恶性肿瘤中低表达的趋势一致，同时也提示miR⁃34a低表达与DLBCL 的发病有关。

根据两项关于DLBCL、慢性淋巴细胞白血病的细胞实验结果，miR⁃34a 的抑癌作用与靶向抑制FOXP1表达有关［6，12］。FOXP1是重要的原癌基因，在结直肠癌、肺癌的发病过程中，FOXP1 通过激活下游细胞周期蛋白、趋化因子受体促进癌细胞的增殖、迁移及侵袭［13⁃14］。本研究结果提示原癌基因FOXP1高表达与DLBCL 发病有关且miR⁃34a 可能靶向FOXP1 并参与DLBCL 的发病。

在阐明DLBCL 中miR⁃34a、FOXP1 表达的变化及相关性后，本研究进一步分析了DLBCL 中miR⁃34a/FOXP1 轴变化的临床意义。在DLBCL病理进展过程中，临床分期增加、LDH 升高，反映预后的IPI 评分增加，Hans 分型也由预后较好的GCB 亚型向预后较差的non⁃GCB 亚型转换［15⁃16］。本研究通过比较不同病理特征DLBCL 可知：随着临床分期增加、LDH 升高、IPI 评分增加及Hans分型变为non⁃GCB 亚型，DLBCL 中miR⁃34a 的表达降低、FOXP1 的表达增加，提示miR⁃34a、FOXP1 表达的变化与DLBCL 病理进展有关。同时，本研究还对DLBCL 患者的无进展生存情况进行了随访，随着miR⁃34a 表达降低、FOXP1 表达增加，患者的无进展生存时间明显缩短，提示miR⁃34a、FOXP1 表达的变化与DLBCL 的预后有关。

综上所述，miR⁃34a 低表达、FOXP1 高表达可能与DLBCL 的发生、病理进展及预后恶化有关，与之相关可能的分子机制是miR⁃34a 靶向FOXP1。但本研究存在局限之处，即对DLBCL预后的随访时间较短，无法得到足够数据分析总生存期，今后应扩大样本量、延长随访时间。