B淋巴细胞功能变化在不明原因复发性自然流产中的作用研究

谭宗建 耿婷 刘人杰 邬卫东

(1.贵州省人民医院生殖医学科，贵州 贵阳 550002；2.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002)

复发性自然流产(recurrent pregnancy loss，RPL)患者中以早期流产多见，严重威胁胚胎的正常着床发育及母体的健康。相关文献[1]表明，RPL发病率约3%～5%，除染色体异常、解剖因素、内分泌因素、生殖道感染、血栓前状态等明确的病因外，仍有约60%患者原因不清，即不明原因复发性自然流产(unexplained recurrent pregnancy loss，URPL)。目前认为，大部分URPL与免疫因素有关。生殖免疫学认为胚胎对于母体来说类似同种半异己的移植物，成功的妊娠有赖于母胎免疫耐受的建立与维持，自然流产则是免疫耐受的终止。目前专家学者们提出了Th1/Th2平衡学说来解释此种情况。且研究[2]证实封闭抗体阴性患者经过配偶淋巴细胞免疫治疗后患者在孕期体内的Th2细胞及其分泌的细胞因子呈活跃状态，参与维持正常妊娠状态。有研究[3]对系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者进行证实，其外周血中B淋巴细胞增殖功能及分泌功能均较健康女性外周血中B淋巴细胞功能增强，提示B细胞淋巴细胞可能在该疾病的发生和发展过程中起着重要作用，而在孕期其病情则会有加重趋势，以上均提示Th2细胞及其分泌的细胞因子所介导的体液免疫反应在正常妊娠时起着不可替代的重要作用。Th2细胞分泌一系列细胞因子介导体内的体液免疫。因此可以认为，母体的体液免疫增强，细胞免疫抑制是维持正常妊娠免疫耐受的重要因素。但妊娠期母体增强的体液免疫有何意义？在诱导母胎免疫耐受中有何作用？近期有学者对自然流产后女性的胎盘组织进行体外培养，发现其可以产生糖基化的免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)并参与母胎界面的免疫耐受，对抗同种异体抗原对胎儿和胎盘产生的免疫作用；相关动物实验亦证实了这一理论[4]。这一研究成果揭示了免疫逃逸的相关机制，并为妊娠生理学和免疫学的进一步研究打开了一个新的维度。本研究拟通过检测URPL患者外周血B淋巴细胞产生抗体的功能变化及B淋巴细胞增殖功能的变化，以不孕患者和自身抗体谱阳性的URPL患者作为对照，初步探讨母体B淋巴细胞功能变化在URPL发病过程中的作用机制。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2016年3—10月在贵州省人民医院生殖中心就诊的复发性自然流产患者。所有患者均通过妇科常规检查、盆腔B超、子宫输卵管碘油造影或宫腔镜检查，胰岛素、血糖及甲状腺功能和自身抗体谱、凝血功能的检查,夫妻双方染色体核型分析及ABO血型检测，病毒及细菌感染的检测，抗子宫内膜抗体、抗精子抗体的检查等排除了因遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、血液高凝状态以及自身免疫系统疾病等因素所致的复发性自然流产。根据病史及生殖中心流产原因筛查结果对患者进行分组。A组(RPL合并早期妊娠患者)：为在我院门诊就诊的满足复发性自然流产诊断的患者，经相关检查及相应治疗后，现已妊娠，hcG升高，B超可见孕囊及原始心管搏动，孕周≤12周者。B组(自身抗体阳性的RPL患者)：为在我科门诊就诊，满足复发性自然流产疾病诊断标准，完善相关检查排除了因遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素以及血液高凝状态等致病因素，而自身抗体为阳性的复发性自然流产患者。C组(自身抗体阴性、封闭抗体阴性的RPL患者)：为在我科门诊就诊，满足复发性早期自然流产疾病诊断标准，完善相关检查排除了因遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素以及自身抗体等因素所致而封闭抗体为阴性的复发性自然流产患者。D组(不孕患者)：收集同期来自生殖中心门诊行不孕检查的患者，经相应检查排除了自身抗体阳性、甲状腺功能异常者，纳入此组作为对照组。每位受试者建立详细病历资料，并充分知情同意。已排除染色体异常，风湿、类风湿、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病、心血管疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、恶性肿瘤等。

1.2实验方法

1.2.1外周血淋巴细胞分离与培养 抽取患者肘静脉血3 mL于EDTA抗凝剂采血管中，并于4 h内处理。超净工作台消毒后，无菌操作，取等量PBS(北京Solarbio 公司)稀释3 mL外周血，并轻翻转混匀。用巴氏管吸取3 mL淋巴细胞分离液(天津灝洋生物华科生物科技有限公司)置于15 mL离心管底部。倾斜离心管45°，将稀释后的血液用注射器沿管壁小心缓慢加入至淋巴分离液上方，形成分离面，并保持两者界面清晰。室温水平将样本离心2 000 rpm×20 min。吸取单个核细胞层(白膜层)，转移至新的无菌离心管中，加入PBS洗涤，并用巴氏管吹洗。室温水平离心2 000 rpm×5 min，弃洗涤液后，再次如前洗涤，并弃洗涤液，留细胞悬液。用恢复至室温的完全细胞培养液重悬细胞，调整细胞浓度为7～8×105/mL。将细胞置于12孔板中培养，每孔加入1 mL细胞悬液培养。每个样本分别设置实验组和对照组。实验组加入SPA(5 μg/mL) (北京Solarbio 公司)及IL-2(10 ng/mL)(英国Peprotech公司)；空白组未加入刺激物。置于37℃，5% CO2培养箱中，培养5 d。

1.2.2B淋巴细胞增殖功能测定 培养后的细胞悬液用移液枪混匀，并分别取200 μL置于96孔板中，每样本每组设置复孔3个，并于空白孔中加入完全培养基200 μL，设置复孔3个，作为调零组。并于每孔中加入20 μL配置好的MTT溶液，置于37℃，5%CO2培养箱中，培养4 h后，取样品于96孔板离心机中离心1 000 rpm×10 min。弃上清，留96孔板板底蓝紫色沉淀物质。每孔加入DMSO100 μL溶解沉淀物，并形成蓝紫色液体。于酶标仪中以中速震荡混匀10 min，以调零组调零并检测490 nm波长处待测孔OD值。MTT结果以刺激指数(SI)表示，计算公式：SI值=(实验组D490 nm值-调零组D490 nm值)/(对照组D490 nm值-调零组D490 nm值)

1.2.3B淋巴细胞分泌功能检测 操作按照人IgG ELISA试剂盒 (北京诚林生物科技有限公司)说明书进行。

2 结 果

早孕患者及自身抗体阳性的患者其外周血B淋巴细胞经过与SPA及IL-2的共同培养后，其增值效果显著，较之其他组别有统计学意义(P<0.05)。但A、B两组之间(P=0.394)，C、D两组之(P=0.786)间，其差别并无统计学意义。自身抗体阳性的患者较之封闭抗体阴性的RPL患者，经过丝裂原及IL-2的刺激其分泌IgG的能力增强，且有统计学意义(P=0.030)，而其余各组间比较其差异均无统计学意义。见表1。

表1 B淋巴细胞功能变化

3 讨 论

免疫细胞T细胞在母胎的免疫耐受方面发挥着重要作用，Th1细胞、Th2细胞是CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子不同分而分化的两个亚型。其不仅可以识别主要组织相容性复合物-Ⅱ(major histocompatibility complex，MHC)类分子，还可以识别抗原并激活B淋巴细胞，使后者分化为浆细胞并分泌特异性抗体，并增强机体体液免疫反应。Th1细胞可分泌IL-2、IFN-γ，主要参与机体细胞免疫反应。而Th2细胞则产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等，抑制Th1细胞因子的产生并刺激B细胞产生抗体、辅助体液免疫反应。与正常妊娠相比，复发性自然流产患者Th1型细胞因子如IL-2和IFN-γ明显升高，外周血IL-10则明显降低[5]。说明Th1细胞及其介导的细胞免疫反应可能在RPL患者的发病机制中发挥着一定的作用。目前国内外研究广泛认为，正常妊娠期母体Th1/Th2平衡偏向Th2细胞为主的免疫反应，并且通过一些列反应介导母体体液免疫反应增强，为胚胎的着床及发育提供适宜的环境，维持正常妊娠。在早孕期间母体内众多免疫细胞、蜕膜基质的局部细胞因子参与母胎界面的免疫耐受，体液免疫在正常妊娠的免疫耐受中发挥着重要作用，在适应性免疫应答中，B细胞有着重要的作用，其介导体液免疫并产生抗体。

本研究表明，在经过系统筛查和相应治疗后，RPL患者再次妊娠时，其外周血中B淋巴细胞经体外培养增殖潜能远较封闭抗体阴性的PRL患者及不孕患者强，该结果提示早孕时，母体内可能通过一系列免疫反应激发了B淋巴细胞的潜能，并可能参与后续一系列体液免疫反应，介导母体对早期胚胎的免疫耐受。近来确有研究发现调节性B细胞可以产生IL-10，抑制Th1细胞介导的免疫应答从而介导妊娠免疫耐受[6]，表明B淋巴细胞可能在正常妊娠的免疫耐受中亦发挥着一定作用。正常妊娠母体可以激发保护胎儿免于免疫反应的aIgG(asymmetric IgG)的产生。但相关研究表明自身免疫疾病患者外周血B细胞类型之间可呈现不平衡表达，其幼稚B细胞的表达增高，并且可以促使相关细胞因子和自身抗体的表达，对妊娠母体及胚胎产生不利影响，引起流产等不良后果[7]。在SLE患者中，外周血中浆母细胞和IgD+CD27+记忆B细胞表达增加，导致患者妊娠期间抗双链DNA抗体滴度增高[8]，母体增强的免疫反应可对胎儿产生不良影响。多种自身抗体可以形成免疫复合物沉积于肾脏，并引起不同程度的肾脏损害，引发肾炎。但是免疫复合物不仅可以沉积于肾脏，其也可以在胎盘局部积聚，影响正常妊娠。抗核抗体(ANA)是引起RPL的重要免疫因素，M.Veglia等[9]用人ANA-IgG处理早孕小鼠并检测其胎盘补体和免疫复合物沉积情况，结果表明经处理的小鼠胎盘组织上免疫复合物增加、补体表达上调，并且流产率较高。这些研究表明体内过度激活的体液免疫反应，促使B淋巴细胞分泌大量的IgG，在体内与抗原发生反应形成免疫复合物，并诱使免疫复合物积聚于胎盘、激活补体系统导致母体对导胎儿的免疫不耐受，从而引起了流产。我们的研究结果表明，自身抗体阳性的RPL患者外周血中淋巴细胞增殖潜能(P<0.01)高于对照组不孕女性；而与封闭抗体阴性的患者相比，其淋巴细胞不仅增殖潜能(P<0.01)增强，其分泌IgG的能力也显著提高(P=0.030，P<0.05)，且差异均有统计学意义。提示自身抗体阳性的患者其体液免疫系统可能被过度激活，与体内的抗原结合，形成免疫复合物，通过复杂的机制，诱导母体内一些列免疫反应，对同种异体移植物—胚胎产生了排斥作用，导致早期自然流产。

国外有研究[10]表明，患体液免疫缺陷疾病的女性其不孕症及自然流产发生率均较正常女性提高。另有个案报道称RPL患者外周血中CD19+B细胞增加，而记忆B细胞则减少，给予糖皮质激素及免疫球蛋白治疗后，患者成功妊娠，且其孕期类型转换的记忆B细胞(switched memory B cells CD27+IgD61)明显增加，并伴CD19+B细胞、初始B细胞的减少[11]。对URPL患者的研究表明其外周血中CD8+T细胞、CD4+T细胞及B-1细胞比例显著增高，CD20+B细胞、CD19+B细胞比例低于正常女性，但其子宫内膜局部T细胞、B细胞及NK细胞等白细胞的表达并无差异[12]。但患者经过静脉注射免疫球蛋白治疗后，在早孕期CD19+B细胞的比例增加。这表明在经过免疫治疗的URPL患者中，体液免疫系统似乎被激活，参与维持正常妊娠耐受。另有研究采用培养正常早孕蜕膜细胞的上清液与外周血B淋巴细胞共培养，可以促进IgG的分泌；而这种作用可被外源性细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-6等)增强[13]。动物实验亦表明[14]在孕早期，B淋巴细胞被激活，其转化值呈上升趋势，T淋巴细胞的转化值则维持较低的水平，而在正常妊娠晚期及分娩日，其外周血中B细胞的表达则低于未妊娠女性。这均表明在早孕期间，母体内可通过一系列生物反应，一定程度上激活体液免疫系统，B淋巴细胞活性增高，使得体液免疫增强，并在维持正常妊娠中发挥着举足轻重的作用。我们的研究表明曾有RPL病史的患者妊娠后，其外周血中B淋巴细胞增殖的潜能较封闭抗体阴性的患者及不孕女性提高，但对其在体外培养的过程产生的IgG进行检测并未发现其与自身抗体阳性RPL患者(P=0.176)、封闭抗体阴性患者(P=0.483)及正常未孕女性(P=0.752)外周血中细胞经培养所分泌的IgG并无明显差异。

近年来国内外对不明原因复发性流产进行了深入的研究认为异常的免疫调节是引起疾病的重要原因。有RPL病史的患者妊娠后，其外周血中B淋巴细胞增殖的潜能较封闭抗体阴性的患者及正常未孕女性提高。而封闭抗体阴性的患者，其外周血中B淋巴细胞在相同的刺激下，细胞增殖水平低于早孕及自身抗体阳性的PRL患者。研究提示母体内的体液免疫调节失衡可能是不明原因复发性自然流产的一个重要因素。不明原因复发性自然流产是多因素作用的结果，对病因分析应从多方面着手，拓宽思路，寻找更好的治疗方法，为解决复发性自然流产这一难题开辟一条行之有效的途径。