同位素内标-QuEChERS结合UHPLC-Q-Orbitrap HRMS法快速检测果蔬中84种除草剂残留

王兴宁，李 志，唐亚峰，李 巧，戴 唯，李 洁，朱 明

(贵阳海关综合技术中心，贵州 贵阳 550081)

0 引言

除草剂是指用来防治杂草和有害植物的药剂，按照化学结构可分为磺酰脲类、咪唑啉酮类、三嗪类、酰胺类、二硝基苯胺类、芳氧苯氧丙酸酯类、二苯醚类、环己烯酮类、硫代氨基甲酸酯类等[1]。GB 2763-2021规定了564种农药10 092项最大残留限量，其中除草剂类农药占据着重要比例，如氟吡禾灵等在果蔬中残留限量为0.02～1 mg/kg[2]。除草剂的使用大大提高了农业生产效率，但也存在一些问题，如作物品种的敏感性、杂草抗药性和残留药害等负面影响，如磺酰脲类除草剂土壤浓度在达到1 g/hm时即可对后茬敏感作物产生药害。虽然除草剂及其代谢降解产物对哺乳动物、鱼类、鸟类和人类毒性很低，但摄人一定量的除草剂可引起腹泻、食欲减退、抑郁，出现肺、肝脏、脾脏和脑膜的严重充血等毒性反应[3]。当前，中国、日本和美国等许多国家和地区已对其在农产品中的除草剂残留规定了严格限量。因此，建立操作简单、快速、准确的对果蔬中多种类除草剂的残留量快速检测方法迫在眉睫。

当前检测除草剂的方法主要有气相色谱-质谱法[4-5]、高效液相色谱法[6]、高效液相色谱-串联质谱法[7-8]和高分辨质谱法[9-10]，但上述方法存在检测的除草剂种类单一、样品前处理操作繁琐、检测通量低、对复杂基质的抗干扰能力弱，易出现假阳性等缺点。QuEChERS方法是美国农业部Anastassiades等人于2003年开发的一种基于固相萃取和基质固相分散技术的预处理方法，具有简单、快速，用时短，受到广大食品安全检测人员的喜爱[11-12]。静电场轨道离子阱(Orbitrap)高分辨质谱具有灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强和高通量等优势，已经被分析工作者逐渐应用到了多种类、高通量农药残留的快速筛查工作中[13]。当前采用同位素内标-QuEChERS结合高分辨质谱检测果蔬中多种类除草剂残留的研究报道甚少。

本文建立了一种同位素内标、优化QuEChERS前处理条件，结合超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测果蔬中84种除草剂的方法。并对实验室日常检测的50批水果蔬菜中84种除草剂残留进行检测，方法具有灵敏度高、杂质干扰少、准确度高等特点，可为果蔬中除草剂残留的风险筛查提供技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

UHPLC-Q Exactive 超高效液相色谱-质谱联用系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)；分析天平PB1502-L(瑞士Metter Toledo公司，感量10 mg)和XP205DR(瑞士Metter Toledo 公司，感量0.01 mg)；移液器(美国Thermo公司)；Elix/Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

乙腈、甲醇、甲酸铵、甲酸(上海安谱有限公司)；无水硫酸镁(MgSO4)和乙酸钠均为农残级(山东西雅试剂)；N-丙基乙二胺(PSA，40～60 μm)，石墨化炭黑(GCB，30～90 μm)，C18(50 μm，60 Å)农残级(上海安谱有限公司)；多壁碳纳米管(MWCNTs，长度10～30 μm，外径 10～20 nm，内径 5～10 nm，纯度>95% ，比表面积>200 m2/g，南京先丰纳米材料科技有限公司)；缓冲盐试剂包：含有6 g无水硫酸镁和1.5 g乙酸钠(天津艾杰尔公司)。84种除草剂标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；同位素内标(±)氟吡禾灵-d4(纯度99.0%)(加拿大Toronto Research Chemical公司)。

单个标准储备溶液：称取84种除草剂标准品各10 mg，分别用乙腈或甲苯溶解并定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL的标准储备溶液，于-20 ℃避光保存。混合标准溶液：再用乙腈配制成10 μg/mL的混合标准溶液和氟吡禾灵-d4的内标溶液，于-4 ℃避光保存。标准工作溶液：取适量的混合标准溶液和内标溶液用乙腈稀释，配置成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL(含内标50 ng/mL)标准工作溶液，于-4 ℃避光保存。

果蔬样品(白菜、柑橘、猕猴桃、马铃薯、结球甘蓝、甜椒、洋葱、芹菜、菠菜、萝卜等)均来自实验室日常抽检的样品。

1.2 仪器工作条件

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS- T3(2.1×50 mm,1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流动相A为5 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸甲醇溶液。二元梯度洗脱程序：0 min时，B保持为8%；0～9 min时，B由8%升至95%；9～11 min时，B由95%升至100%；11～14 min时，B由100%降至8%；12～15 min时，B保持在8%。

质谱条件：喷雾电压为 3.5 kV；辅助气加热源温度：350 ℃；金属毛细管温度：320 ℃；鞘气压力：4.55 L/min(35 arb)；辅助气压力：3 L/min(10 arb)；扫描范围(m/z)：100～700 Da；管状透镜电压：50 V；包含模式：开；运行时间：15 min。一级质谱全扫描(Full scan)分辨率：R=70 000；自动增益控制目标离子数(AGC target)：3e6；最大注入时间：250 ms。数据依赖二级离子全扫描(data-dependent Full MS2，ddMS2)分辨率：R=35 000；归一化碰撞能(NCE)：20、45和70 eV；自动增益控制目标离子数(AGC target)：2e5；最大注入时间：120 ms；动态排除：10 s;循环次数(Loop count):5；隔离宽度(Isolation width):m/z4.0。84种除草剂的质谱信息见表1。

表1 84种除草剂的CAS号、分子式、离子类型、保留时间、精确质量数、质量数测定值、二级碎片离子Tab.1 CAS no., molecular formula, ion formation,retention time,accurate mass,Mass determination and product ion of the 84 herbicides

续表1

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1.3 样品的制备

果蔬样品粉碎后，准确称取10 g(精确到0.01 g)于50 mL聚丙烯离心管中，依次加入内标50 μL(10 μg/mL)、10 mL含1%乙酸乙腈溶液，涡旋5 min。加入6 g无水硫酸镁和1.5 g 乙酸钠，剧烈震荡2 min使之混合均匀，5 000 r/min离心5 min。取上清液1.5 mL至预装有150 mg 无水硫酸镁、25 mg C18和25 mg MWCNTs的微型螺旋盖聚丙烯离心管中，涡旋混合2 min，68 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm 滤膜，待UHPLC-Q-Orbitrap HRMS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化和谱库的建立

根据84种除草剂的分子结构和性质，选择Full MS模式进行一级质谱母离子全扫描，设置质量范围m/z80～1 100、分辨率(FWHM)70 000，对100 ng/mL混合标准溶液进行检测，依据每个化合物的理论质量数提取一级母离子色谱图，得到保留时间和精确质量数，84种除草剂母离子的实际质量数偏差均小于5×10-6，符合定性要求[14]。选择二级质谱Full MS/dd MS2模式，在包含列表(Inclusion list)中输入每个化合物的母离子精确质量数，依据保留时间设置扫描时间段，使质谱有针对性的扫描和裂解，并优化碰撞能量得到最佳二级碎裂子离子质谱图。选择一级质谱全扫描的母离子作为定量离子，至少选择2个具有代表性的二级质谱碎裂离子作为定性离子。结果表明，大多数除草剂在ESI+模式具有较好的响应强度，因此，选择[M+H]+离子峰的精确质量数。同时建立包括名称、保留时间、化学式、精确质量数及特征碎片离子等信息的一级和二级质谱扫描数据库。84种除草剂的质谱参数信息见表1。

2.2 色谱条件的优化

除草剂多属于中等极性和弱极性化合物，在弱极性的T3柱和C18柱上均具有较好的保留。试验中比较Waters ACQUITY UPLC HSS- T3(2.1×50 mm，1.7 μm)和Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 × 150 mm，4.6 μm)，结果表明，ACQUITY UPLC HSS-T3柱对中等极性化合物的保留要优于Agilent ZORBAX SB-C18柱。因此，选择ACQUITY UPLC HSS-T3柱获得更为优异的分离效果。

流动相添加剂如甲酸铵和甲酸可显著改善色谱峰的分离度与灵敏度。试验中以甲醇-水和乙腈-水为流动相均不能得到良好的峰形，并对甲醇-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸铵的水溶液-5 mmol/L甲酸铵的甲醇溶液、5 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸甲醇溶液的4种流动相进行比较。结果表明，使用5 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸水溶液-5 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸甲醇溶液84种类除草剂均获得理想分离度和灵敏度。在确定的色谱-质谱条件下，84种除草剂混标(100 ng/mL)总离子流图见图1；猕猴桃样品总离子流图见图2；甲草胺、锈去津、敌草净、乙羧氟草醚的一级全扫描色谱图见图3。由图3可知目标物响应强度高、无干扰、分离度高、峰形良好。

图1 84种除草剂混标(100 ng/mL)总离子流图Fig.1 The total ion chromatogram of 84 herbicide mixtures (100 ng/mL)

图2 猕猴桃样品总离子流图Fig.2 The total ion chromatogram of kiwifruit samples

图3 甲草胺、锈去津、敌草净、乙羧氟草醚的色谱图和质谱图Fig.3 The chromatograms and mass spectra of alachlor,atrazine,desmetryn and fluoroglycofen-ethy

2.3 内标物的选择

考虑到不同种类除草剂的化学差异较大，且苯氧羧酸类除草剂较其他种类除草剂更难以被提取和净化，因此，本文以属于苯氧羧酸类除草剂的氟吡禾灵和氟吡禾灵d4同位素内标作为重点考察对象。结果表明，氟吡禾灵d4同位素内标具有离子化效果好、酸性环境稳定性好、定量误差小等优势，并适用于84种除草剂内标法定量。

2.4 提取溶剂的选择

QuEChERS法集提取、净化为一体的前处理方法，可针对样品基质情况选择不同吸附剂类型及组合，具有净化效果好、操作灵活、准确度高等优势，已经成为多批次、高通量农药残留检测较为理想的前处理手段[11]。由于部分除草剂含有羧基基团，在溶液中呈酸性，使用1%乙酸乙腈为提取溶剂可形成稳定的缓冲体系，提高了酸性农药的离子化效率，同时样品基质的共萃取成分较乙腈少。因此，选择1%乙酸乙腈为提取溶剂。

2.5 净化条件的优化

试验中选择基质复杂的空白菠菜样品添加9种不同种类除草剂进行处理，提取液转入预装有4种不同组合的吸附剂(MgSO4、C18、PSA、GCB和MWCNTs)的2 mL微型具螺旋盖离心管中，评价回收率结果。优化的吸附剂组合操作步骤如下：1)MgSO4150 mg和C1825 mg；2)MgSO4150 mg和PSA 25 mg；3)MgSO4150 mg和GCB 25 mg；4)MgSO4150 mg和MWCNTs 25 mg。结果表明：1)、3)和4)均获得满意的结果，除去色素、脂类等杂质能力排序为：4)>3)>1)，同时也表明PSA的吸附剂不能用于该方法，易导致含羧基基团如氟吡禾灵等目标物的损失。最终考虑适合于广泛基质样品净化的吸附剂组合为MgSO4150 mg，C1825 mg和MWCNTs 25 mg。图4为4种吸附剂组合对菠菜样品中9种类除草剂的吸附效果比较。

注：吸附剂组合1～4指：1)MgSO4 150 mg和C18 25 mg；2)MgSO4 150 mg和PSA 25 mg；3)MgSO4 150 mg和GCB 25 mg；4)MgSO4 150 mg和MWCNTs 25 mg。图4 不同吸附剂组合对菠菜样品(添加0.05 mg/kg 9种不同种类除草剂)的回收率结果Fig.4 The effect of clean-up on nine herbicides with different sorbents for spinach samples(spiked at 0.05 mg/kg for nine herbicides)

2.6 基质效应

果蔬中色素、有机酸和脂类等杂质易引起基质增强或基质抑制效应，有关研究表明基质种类、基质数量和目标物化学性质对基质效应有一定影响[15]。基质效应的评估常采用不同基质代表性样品，如菠菜(高色素)和猕猴桃(高酸样品)来制备基质匹配标准曲线。

按照以下公式计算基质效应：

ME(%)=(m基质-m溶剂)/m溶剂×100%

其中ME表示基质效应，m基质和m溶剂表示为基质和溶剂匹配标准曲线的斜率，当ME为-20%～20%、-50%～-20%或20%～50%、<-50%或>50%时，分别表示轻微、中等和较强的基质效应。结果表明，在菠菜和猕猴桃基质中84种除草剂的ME为-16%～14%，其基质效应轻微可以忽略[16]。结果表明，同位素内标法定量和优化的吸附剂组合净化，不仅保证较高的回收率，还将基质效应的影响降至最低，无需采用基质匹配标准工作曲线的方式进行补偿，缩短了样品的前处理时间。图5为84种除草剂的基质效应结果。

图5 84种除草剂的基质效应结果Fig.5 Matrix effects(ME)of multiple herbicides

3 方法学考察

3.1 线性范围

通过内标法(氟吡禾灵-d4作为内标，浓度为50 ng/mL)配置5.0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL系列溶剂匹配标准工作溶液进行UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析，以浓度范围(x，ng/L)对分析物与内标峰面积比(y)来构建标准曲线。结果表明，84种除草剂的相关系数(r2)均大于0.99，能满足分析要求，如表2所示。

表2 84种除草剂残留的线性范围、线性方程、相关系数和定量限、加标回收率及精密度实验结果(n=6)Tab.2 Linear ranges,Linear equation,correlation coefficients,limits of quantitation,spiked recoveries and precisions of 84 herbicides (n=6)

续表2

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3.2 样品回收率和精密度

取2种果蔬的空白样品(菠菜和猕猴桃)，分别添加84种类除草剂标准溶液，添加水平为0.01 mg/kg、0.05 mg/kg和0.1 mg/kg，每个水平重复6次试验。结果表明，添加84种除草剂的样品的平均回收率在68.2%～109.4%，之间，精密度RSD在2.1%～16.2%之间，结果见表2。

3.3 定量限

在欧盟(EU)No396/2005法规及最新修改单中[16]，果蔬中除草剂的最大允许残留限量(MRL)低至0.01 mg/kg，本方法的定量限(LOQ)采用加标回收的方法进行验证，菠菜和猕猴桃基质样品的定量限均能达到0.01 mg/kg，满足国内外限量法规对除草剂残留限量的检测要求。

3.4 实际样品测定

按照建立的方法对实验室日常检测的50批果蔬样品进行检测，包括白菜、柑橘、猕猴桃、马铃薯、结球甘蓝、甜椒、洋葱、芹菜、菠菜、萝卜及苹果等样品。其中大多数的果蔬样品未检出除草剂残留，仅有2批苹果样品检出莠去津残留，浓度分别为0.05 mg/kg和 0.07 mg/kg。结果表明，本方法适用于果蔬中84种除草剂残留的检测。

4 结论

本研究建立了同位素内标QuEChERS结合超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法快速检测果蔬中84种除草剂的方法。优化QuEChERS前处理步骤可实现84种除草剂的完全提取与净化；方法的线性关系良好r2大于0.99；以菠菜和猕猴桃2种基质样品添加3水平的回收率试验，回收率在68.2%～109.4%之间，相对标准偏差在2.1%～16.2%之间；大多数除草剂的定量限低至0.01 mg/kg，满足国内外农药残留限量法规需求。该方法实现果蔬中84种常见除草剂的分析检测，具有灵敏度高、稳健性好、专一性强、准确度高的优势，为日常除草剂残留监控检测提供实用的技术手段。