前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin 9型及其与脂类物质代谢紊乱、动脉硬化性疾病关系的研究进展▲

言 纬 李近都

(右江民族医学院附属医院1 心血管内科，2 肝胆外科，广西百色市 533000)

【提要】 脂类物质代谢紊乱与心血管疾病、肥胖、糖尿病、脂肪肝和肿瘤等有关，其发病机制尚未完全清楚。血液中胆固醇等脂类物质之间通过非共价键结合形成脂蛋白复合物，通过载脂蛋白受体(APR)进入胞内，并在细胞器内内化，再通过APR以循环再利用。前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin 9型(PCSK9)属于蛋白酶K分泌型蛋白，主要由肝脏分泌，具有促进肝细胞再生、神经分化，以及调节细胞凋亡、炎症反应和胆固醇内化等功能。近期研究发现，PCSK9是在胆固醇内化的同时保障APR不受损害的关键蛋白，PCSK9基因突变及其编码蛋白变异，可导致胆固醇与APR的亲和力增强，促使细胞器内的APR降解，导致APR的数量异常减少，从而影响胆固醇的循环利用，诱发高胆固醇血症，在动脉硬化的发生和发展中发挥重要作用。PCSK9已在动脉硬化性疾病的早期识别、临床进展机制及药物靶标方面成为研究热点。本文就PCSK9及其与脂类物质代谢紊乱、动脉硬化性疾病关系的研究进展进行综述。

枯草杆菌蛋白酶又称舒替兰酶，属于丝氨酸蛋白酶K分泌型蛋白，主要由肝脏分泌，因其基因首先在枯草杆菌中被克隆而得名[1]。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9，PCSK9)，又称为神经细胞凋亡调节转化酶1，由PCSK9基因编码，是前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员[2]。血液中胆固醇等脂类物质之间通过非共价键结合成脂蛋白复合物，在载脂蛋白受体(apolipoprotein receptor，APR)作用下进入胞内，并在细胞器内内化，再通过APR以循环再利用[3]。有研究发现，PCSK9是在胆固醇内化的同时保障APR不受损害的关键蛋白，PCSK9基因突变及其编码蛋白变异，可导致胆固醇与APR的亲和力增强，促使细胞器内的APR降解，导致APR的数量异常减少，从而影响胆固醇的循环利用，诱发高胆固醇血症[4]。而得克萨斯大学西南医学中心在2002年开展的达拉斯心脏研究项目中发现，PCSK9基因的某些位点发生突变能够纠正高血压患者的脂类物质代谢紊乱，并大幅度降低患者的血管疾病发生率[5]。至此研究者们发现PCSK9基因不同位点的突变，可对机体产生不同的影响，某些位点突变可导致胆固醇水平增高，是脂类物质代谢紊乱及动脉硬化的致病因子，而另一些位点突变可导致胆固醇水平降低，是脂类代谢紊乱及动脉硬化的保护因子。近年来PCSK9在脂类物质代谢紊乱及动脉硬化性疾病中的调控作用研究取得新进展[6]，本文就这方面进行综述。

1 脂类物质代谢紊乱与动脉硬化

化学上由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物(胆固醇、三酰甘油、胆固醇酯、磷脂和糖脂等)称为脂类物质，这一类有机化合物为不溶于水而易溶于脂肪溶剂(醇、醚、氯仿、苯)的非极性有机溶剂，与生命代谢息息相关[7]。脂类物质中极性脂的非极性部分与载脂蛋白之间通过疏水性相互作用，在肝脏内通过非共价键结合形成具有稳定脂蛋白结构的脂蛋白复合物，脂蛋白复合物在血液中循环运转，并通过APR介导进入胞内完成代谢过程[8]。APR有极低密度脂蛋白受体、LDL受体、清道夫受体和载脂蛋白E受体等类型，其能与载脂蛋白配体结合，介导细胞对三酰甘油、胆固醇和载脂蛋白等脂类物质的摄取与代谢，是脂类物质进入细胞器的介导蛋白，可有效调控脂类物质的胞吞和内化，对脂类物质代谢、血浆脂类物质水平的调节有重要作用[9]。脂类物质的主要生物学功能是提供和储存能量、信号识别和传递，同时还可以作为生物膜的骨架组成部分、维生素和色素的前体、糖基载体、酶激活剂、生长因子与抗氧化剂等。

在脂类物质代谢过程中，三酰甘油、胆固醇等脂类物质在血液中与载脂蛋白相互嵌合形成脂蛋白微粒，进而被运输到机体各组织细胞；载脂蛋白配体再与相应的APR结合，介导脂类物质进入胞内进行代谢[10]。脂类物质代谢紊乱是指机体在先天性或获得性因素作用下，体内脂类物质的消化、吸收、排泄失衡，导致血液及其他组织器官中脂类物质代谢产物的质和量发生异常。目前认为遗传与环境因素异常是导致三酰甘油、胆固醇摄入与消耗失衡的主要原因，载脂蛋白及APR、脂类物质代谢相关蛋白的编码基因突变，从而影响脂类物质转运、内化和再生，造成脂类物质代谢紊乱。

动脉硬化病变始于内膜，发病初期为动脉壁内层表面出现一层小米粥样的脂质条纹，随着疾病的进展脂质条纹逐渐浸润到脉管中层并形成纤维斑块样病变，受累的血管出现弹性降低、管壁增厚、管腔变窄等病理性改变，严重者出现脉腔阻塞，局部组织器官缺血或坏死，或受累血管内膜出血而出现血栓、纤维组织增生、钙质沉着等继发性改变[11]。脂类物质代谢紊乱对动脉硬化的发生、发展有重要影响[12]，脂类物质进入血管内后可沉积在血管壁上，使血管腔变窄，并促使血管发生粥样硬化。然而参与脂类物质代谢的物质众多，通路复杂，脂类物质代谢引起动脉硬化的机制尚未完全。有研究表明，载脂蛋白基因、APR基因、胆固醇调节元件结合蛋白基因和PCSK9基因等多种基因的突变参与脂类物质代谢紊乱及动脉硬化的发生和发展[13]。

2 PCSK9基因及蛋白的结构、功能

PCSK9基因广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物，具有重要的生理活性[14]。研究表明，不同物种的PCSK9基因表达谱各有特征[15]。其中，人PCSK9基因位于第1号染色体短臂第3区2号带，基因长度约22 kb，有13个外显子和12个内含子。PCSK9基因在肝、肠道、肾、脑和皮肤等组织中均有表达，但主要在肝细胞表达，在肝内参与脂质代谢。

PCSK9蛋白由699个氨基酸残基组成，按其结构和功能的不同可分为N端信号区、前功能区、催化区和C端功能区4个部分，见图1、图2。N端信号区位于第1～30位氨基酸残基，为PCSK9的信号肽结构域；前功能区位于第31～152位氨基酸残基；催化区位于第153～448位氨基酸残基；C端功能区位于第449～699位氨基酸残基，为PCSK9的富含半胱氨酸残基结构域[16]。PCSK9的N端信号区是携带其复合体跨膜运输的基本识别信号，位于肽链的氨基(-NH2)端。PCSK9被释放到细胞外后，其N端信号区不会被信号肽酶所切除，而是作为前导肽，通过信号肽-胞质载脂蛋白受体-膜受体的三元识别将脂质送进溶酶体。PCSK9的前功能区由2个α螺旋和1个β折叠组成，其中β折叠呈四键反向平行，与催化区构成可溶性交界面，可以阻断自身与催化区的催化三联体融合，防止自身催化反应发生。PCSK9的催化区由酸-碱-亲核三联体(丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸3个氨基酸残基)构成，为亲核反应水解蛋白功能区[17]。PCSK9的C端功能区为半胱氨酸-组氨酸-天冬氨酸三联体，其作用类似于丝氨酸蛋白酶中的三联体，目前关于PCSK9的C端功能区结构域催化作用的研究较少[18]。PCSK9前体首先在核糖体中进行翻译，然后进入内质网腔经过折叠、组装、糖基化等加工，再从细胞内出芽，转移到高尔基体进一步加工成为成熟的PCSK9并释放到细胞外。PCSK9基因编码的蛋白经过自动催化处理后，以非活性蛋白酶的形式持续分泌进入细胞外间质和反式高尔基体网络[18]。

图1 PCSK9蛋白的肽链功能分区

图2 PCSK9 蛋白的结构图[19]

3 PCSK9与脂类物质代谢紊乱、动脉硬化性疾病的关系

目前认为PCSK9在脂类物质代谢、决定脂类物质代谢途径和调节血脂水平等方面都有重要的作用，甚至认为PCSK9足以揭开载脂蛋白、胆固醇和三酰甘油代谢紊乱及动脉硬化性疾病的发生机制，成为控制脂类物质紊乱、防控动脉硬化性疾病的一个重要靶点[20]。在正常的情况下，脂类物质与PCSK9蛋白在肝细胞膜表面与LDL受体、极低密度脂蛋白受体、清道夫受体和载脂蛋白E受体等相结合形成脂蛋白复合物，激活并介导脂类物质进入细胞器，脂类物质进入细胞器后从脂蛋白复合物中分离并在溶酶体内降解，而脂蛋白受体则可以重新循环利用。PCSK9具有介导脂类物质内化、调节血浆LDL水平的功能，这种代谢通路被称为PCSK9-脂类物质调控轴。有学者发现部分LDL-C水平低下的非洲裔美国人PCSK9等位基因突变率较高，其血液中完全检测不到PCSK9蛋白，但对其健康基本没有负面影响，血管疾病患病率很低[5]。研究显示，PCSK9基因获得型突变致PCSK9蛋白表达量增高的患者，其脂蛋白胆固醇升高，是导致遗传性高胆固醇血症发生的原因之一[16]。有学者发现，过表达PCSK9的小鼠，其肝脏LDL受体水平明显降低，而LDL-C水平明显升高[21]。还有学者发现PCSK9基因第127位氨基酸残基由丝氨酸突变成精氨酸(S127R)的单突变患者LDL受体水平降低，认为PCSK9基因功能突变可以导致LDL-C水平升高[22]。

临床研究表明，PCSK9基因多态性变异，例如PCSK9基因D129G、D374Y、E670G、C679X、N157K、Q554E、R237W、R46L、S462P和Y142X等位点的多态性变异所产生的不同表型与脂类物质内化的调控密切相关，但PCSK9基因的不同表型对脂类物质内化的调节作用各不相同[23]。有学者针对不同LDL水平的人群基因多态性遗传进行筛查，发现PCSK9存在两种不同功能类型的基因突变：(1)功能获得型突变。主要突变位点为C161T、D129G、D374Y、E670G、F216L、H553R、I474V、N157K、R128S、R306S和S127R等，突变率较低，目前认为其表型可作为血浆LDL水平升高的独立预测因子，可用于判断冠状动脉粥样硬化的严重程度。该突变型基因编码的PCSK9蛋白对LDL受体的降解作用增强，使LDL-C水平升高，导致高胆固醇血症[24]。(2)功能缺失型突变。主要突变位点为A443T、C679X、G106R、L253F、N157K、Q554E、R237W、R46L、S462P和Y142X等，突变率较高，其表型可削弱或沉默PCSK9上调LDL水平的能力，使LDL水平降低15%～28%，导致低胆固醇血症，使缺血性心脏病发生率降低47%～88%[25]。除此之外，LDL受体活性在转录过程中还受到甾醇调节元件结合蛋白2 (sterol regulatory element-binding protein 2，SREBP2)的调节，转录后受PCSK9影响。和LDL受体一样，PCSK9在启动区含有一个固醇调节元件，其表达水平也受SREBP2的调节[24]。细胞内胆固醇水平降低时，胞质中的SREBP2被激活并使胆固醇发生核转移，与LDL受体及PCSK9的启动子固醇调节元件结合，同时激活LDL受体及PCSK9基因转录，增强LDL受体的内吞作用，以促进血浆中的LDL携带更多的胆固醇进入胞内内化[26-27]。PCSK9作为一种负反馈因子，可有效调控LDL受体[25-28]。

4 小 结

脂类物质代谢紊乱及动脉硬化相关的基因和蛋白质精细调控机制目前尚未完全阐明，深入研究PCSK9对脂类物质的调节机制，对于有效改善脂类物质代谢紊乱，降低动脉硬化患者游离脂肪酸、胆固醇、LDL、极低密度脂蛋白水平，以及控制动脉硬化的发生和发展有重要意义。研发PCSK9的小分子蛋白抑制剂、反转录寡核苷酸、小分子干扰RNA、单克隆抗体和疫苗等分子靶向药物，对于有效控制脂类物质代谢紊乱及动脉硬化性疾病有积极的作用。