三种虫生菌协同毒性及与有机肥耦合效应研究

谢永红，聂 铭,2，陈 霞，廖敦秀*

（1.重庆市农业科学院，重庆 401329；2.西南大学，重庆 400715）

蚜虫是繁殖最快的昆虫之一，主要分布在北半球温带地区和亚热带地区。蚜虫柔软的身体无法保护它免受天敌和疾病的侵害，因此蚜虫发展出了多种自我保护的防御方式，从而增大了植保难度。根结线虫是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫[1-2]。对作物病虫害须严格实行“预防为主，综合防治”植保方针，着重抓好农业、物理防治措施，配合化学及生物防治，才能有效地减轻其危害[3]。目前已有大量关于生防菌防控报道，然而研究发现平板上抑菌作用明显的拮抗菌在盆栽和田间试验中的防病效果不稳定[4-5]。大量生防菌施用到土壤后，由于缺少营养来源，不能在土壤形成优势种群，难以有效抑制土传病害的发展[6]。由于培养基的营养成分和含量与土壤环境截然不同，拮抗菌施入土壤后，缺少足够的营养资源，不能大量定殖或者不能产生足够的拮抗物质，进而导致其生防效率不高[7]。在植物根际土壤中存活着大量的微生物，这些微生物中的部分及其自身的代谢产物能够抑制病原微生物的生长繁殖，使得从土壤中分离拮抗细菌并利用其防治土传病害成为可能，这不仅能克服使用农药带来的环境污染，而且能避免农药造成的病原菌产生抗药性等问题[8-9]，因此日益受到重视。据报道，用苹果渣与荧光假单胞杆菌、哈茨木霉和绿色木霉复合使用可以最大限度抑制尖孢镰刀菌香蕉专化型[10]，用非致病尖孢镰刀菌与恶臭假单胞菌复合使用可以抑制剑麻枯萎病和黄瓜枯萎病[11-12]。本研究通过培养白僵菌、绿僵菌、淡紫紫孢菌，研究单独菌种对病虫的毒性及协同作用，寻求高效生防效果的菌株，在此基础上制备微生物有机肥，研究不同配比有机肥的实际效能，以期为生物有机肥高效防控虫害提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试虫生真菌为白僵菌（Beauveria）、绿僵菌（Metarhizium）、淡紫紫孢菌（Purpureocilliumsp.），均由重庆微核生物科技有限公司提供；选择2 日龄的蚜虫、地蚕、根结线虫作为虫生真菌的防杀对象。

1.2 试验方法

1.2.1 三种虫生真菌毒性试验

配制马铃薯葡萄糖琼脂PDA 培养基，对白僵菌、绿僵菌、淡紫紫孢菌进行活化，获得生长旺盛的三种虫生真菌菌种。培养基配制参照文献[13]进行。以150头2日龄蚜虫为寄主，设置孢子悬浮液含量共五个水平，分别为1×105、1×106、1×107、1×108、1×109cfu·mL-1，各处理喷施3 d 后每隔2 d 用显微镜观察蚜虫死亡头数，每个水平3 次重复，共计45 个毒性观察试验。利用最小二乘法拟合各虫生菌处理浓度与蚜虫死亡率的回归模型。

1.2.2 三种虫生真菌拮抗性试验

配制PPDA 培养基，采用平板对峙法，将活化的三种原菌打成6 mm 菌饼，置于PPDA 培养基远离中心4 cm 的圆周上等分间隔分布，3 次重复，平放于25 ℃恒温箱培养，5 d 后观察三种虫生真菌在PPDA 培养基上的生长情况及抑菌带的宽度。

1.2.3 三种虫生菌协同杀虫试验

对活化后的三种虫生菌进行组合，组合方式设置为“白僵菌+绿僵菌”“绿僵菌+淡紫紫孢菌”“白僵菌+淡紫紫孢菌”“白僵菌+绿僵菌+淡紫紫孢菌”四种，菌剂浓度为1×109cfu·mL-1，对蚜虫、地蚕、根结线虫进行毒性测定，11 d 后观察试验结果；以单独的三种虫生菌作为对照。根据校正死亡率减去理论致死率计算得到协同毒力指数。

1.2.4 生防菌群与有机肥耦合增效试验

通过设置不同白僵菌-淡紫紫孢菌组合菌群与油饼、有机肥配施水平，观察生防菌与有机肥耦合效应。设置的处理分别为“5%油饼+95%有机肥”“清水+5%菌剂”“5%油饼+95%有机肥+2%菌剂”“5%油饼+95%有机肥+5%菌剂”“5%油饼+95%有机肥+10%菌剂”“10%油饼+90%有机肥”“10%油饼+90%有机肥+2%菌剂”“10%油饼+90%有机肥+5%菌剂”“10%油饼+90%有机肥+10%菌剂”“15%油饼+85%有机肥”“15%油饼+85%有机肥+2%菌剂”“15%油饼+85%有机肥+5%菌剂”“15%油饼+85%有机肥+10%菌剂”，共计13 个处理，以“5%油饼+95%”有机肥为对照。将各处理与试验土壤充分混合，选择100株植物进行根结线虫感染观察。并用响应曲面法进行试验数据分析，求出最优有机肥与真菌配比。

1.3 数据处理与分析

试验数据利用Excel 2013 进行整理与统计，利用SPSS 19.0进行方差和回归分析，利用Design expert 8.0进行响应面试验回归及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 三种虫生菌对蚜虫的毒性

以150 头2 日龄蚜虫为寄主，观察1×105、1×106、1×107、1×108、1×109cfu·mL-1孢子悬浮液浓度下蚜虫死亡头数，计算出药后3～11 d的校正死亡率（见表1）。

表1 白僵菌、绿僵菌、淡紫紫孢菌菌株对蚜虫的毒力

药后11 d，对照的蚜虫正常死亡率为6.67%～9.33%；由低至高不同浓度的白僵菌菌株对蚜虫的校正死亡率分别为28.57%、38.57%、66.43%、79.29%、85.71%，绿僵菌对蚜虫的校正死亡率分别为12.14%、26.43%、49.29%、63.57%、77.14%，淡紫紫孢菌对蚜虫的校正死亡率分别为17.86%、45.71%、58.57%、69.29%、80.00%。三种虫生菌株均随着孢子浓度增加，对蚜虫的致死率越高；其中白僵菌、淡紫紫孢菌孢子浓度大于1×107cfu·mL-1时，蚜虫死亡率均大于50%，绿僵菌孢子浓度为1×107cfu·mL-1时，蚜虫死亡率接近50%。

以浓度为变量，11 d 后蚜虫的死亡率为响应量，采用最小二乘法建立回归模型，结果见表2。白僵菌、绿僵菌、淡紫紫孢菌的浓度与蚜虫致死率之间均服从对数函数，其相关系数分别为0.934 7、0.953 6、0.997 5，回归模型为极显著，说明得到的拟合模型是有效的，能够很好地预测不同浓度对蚜虫的致死率。通过回归方程得到白僵菌、绿僵菌、淡紫紫孢菌对蚜虫50%致死浓度分别为5.048×106、1.155×107、6.962×106cfu·mL-1，说明三种虫生真菌对蚜虫的毒力大小为白僵菌＞淡紫紫孢菌＞绿僵菌。

表2 白僵菌、绿僵菌、淡紫紫孢菌菌株对蚜虫的毒力回归方程

2.2 拮抗试验

观察三种虫生真菌在PPDA 培养基上的生长情况，发现三种虫生真菌的菌落都能正常生长，菌落交界处都没有产生任何抑菌带，说明白僵菌、绿僵菌和淡紫紫孢菌菌株三种虫生真菌菌株相互之间都没有生长拮抗性，可用于组合杀虫菌群。

2.3 生防菌群协同杀虫效果

将不同虫生真菌菌株进行组合后杀虫，测定不同组合的协同杀虫效果（见表3、表4、表5），结果发现组合菌群的杀虫效果均优于单一菌株的杀虫效果。白僵菌+淡紫紫孢菌组合菌群对蚜虫、根结线虫的校正死亡率分别为96.69%、94.48%，分别大于其84.23%、90.17%的组合理论致死率；对蚜虫、根结线虫的协同毒力指数分别为3.66、4.77，具有一定的协同杀虫效果。其他组合菌群对蚜虫、根结线虫的校正死亡率均低于组合理论致死率，协同毒力指数均为负值。白僵菌+绿僵菌组合菌群对地蚕的校正死亡率为91.16%，大于组合理论致死率（84.2%）；对地蚕的协同毒力指数为8.23，具有一定的协同杀虫效果。其他组合菌群对地蚕的校正死亡率均低于组合理论致死率，协同毒力指数均为负值。白僵菌+绿僵菌+淡紫紫孢菌组合菌群对蚜虫、地蚕、根结线虫的致死率均较高，但均未超过其组合理论致死率，无协同杀虫效果。

表3 不同菌群对蚜虫的协同杀虫效果

表4 不同菌群对地蚕的协同杀虫效果

表5 不同菌群对根结线虫的协同杀虫效果

2.4 生防菌群与有机肥耦合效应

由生防菌协同杀虫效果得到白僵菌+淡紫紫孢菌组合的协同毒力指数最高，因此以该菌群与油饼、有机肥配施，设置配比试验。由表6结果可见，不同有机肥配比提升白僵菌+淡紫紫孢菌组合菌群根结线虫防效5.3～26.4 个百分点。在15%油饼添加比例范围内，有机肥C/N与组合菌群的杀虫效果呈负相关，在10%油饼添加比例有机肥提高根结线虫平均防效16.5%。综合考虑有机肥载体成本和防治效果，以10%油饼+90%有机肥组合作为适宜的组合菌群有机肥载体。在有机肥载体中，白僵菌+淡紫紫孢菌组合菌群浓度与杀虫效果呈正相关，5%菌剂添加量对根结线虫的防效达到70%以上。

表6 白僵菌+淡紫紫孢菌组合菌群在不同有机肥载体中的杀虫效果

为获得优化的菌肥耦合配比，通过响应面设计试验方案，因子分别为有机肥、油饼、白僵菌+淡紫紫孢菌组合菌剂，试验观察指标为根结线虫杀虫率。由表7 结果可见，第11 组即“85%有机肥+10%油饼+10%菌剂”组合对根结线虫的防效最高，达到74.58%。

根据表7 的试验结果，通过Design-Expert 软件中Analysis 模块进行方差分析可确定回归方程。分析得到白僵菌+淡紫紫孢菌组合菌群与油饼、有机肥配施对根结线虫防效的多元二次回归方程为：

表7 菌肥耦合响应面试验设计及结果

（1）式中，y为根结线虫防治效果，单位为%；A为有机肥比例，%；B为油饼比例，%；C为菌剂浓度，%。

由一次项系数大小可以看出，C因素（菌剂浓度）对菌肥耦合杀虫效果的影响最为显著，A因素（有机肥比例）次之，B因素（油饼比例）最弱。通过方差分析表明，A因素和C因素对菌肥耦合杀虫效果的影响达到极显著水平，B因素和C因素交互作用对菌肥耦合杀虫效果的影响达到显著水平。利用Design-Expert 软件绘出模型中AB、AC和BC交互项的响应曲面（见图1），响应曲面的陡峭程度，反映了因素对试验的影响程度，如果曲面陡峭程度高，说明该因素对试验结果影响大，反之，则对试验结果影响小。

图1 ABC因素交互作用对根结线虫防治效果的响应

通过数学模型对菌肥耦合条件进行优化，利用Design-Expert 软件中Optimization预测优化功能分析可得到菌肥耦合优化条件，最优线虫防效达到80.5%，此时的菌肥优化配比为有机肥80.5%、油饼14.3%、“白僵菌+淡紫紫孢菌”组合菌剂8.4%。综合考虑生产成本和杀虫效果因素，确定有机肥中添加10%油饼和8%组合菌群作为优化的生防菌群与有机肥耦合增效配比。

3 结论与讨论

据报道，解淀粉芽孢杆菌能够有效抑制灰霉病、青霉病等真菌病害[14]，但目前国内外尚未发现利用白僵菌、绿僵菌、淡紫紫孢菌防治蚜虫和根结线虫的报道。本文通过试验得到白僵菌、绿僵菌、淡紫紫孢菌对蚜虫50%致死浓度分别为5.048×106、1.155×107、6.962×106cfu·mL-1，说明三种虫生真菌对蚜虫的毒力大小为白僵菌＞淡紫紫孢菌＞绿僵菌。白僵菌、绿僵菌和淡紫紫孢菌菌株三种虫生真菌菌株相互之间都没有生长拮抗性，可用于组合杀虫菌群，白僵菌+淡紫紫孢菌组合菌群对蚜虫、根结线虫的协同毒力指数分别为3.66、4.77，白僵菌+绿僵菌组合菌群对地蚕的协同毒力指数为8.23，具有一定的协同杀虫效果，其余为负值，说明协同效果降低。生物有机肥产品的质量直接影响使用效果，而产品质量的关键指标是产品的有效活菌数。生物有机肥的活菌数量决定于产品生产工艺，而供微生物生长的有机质载体是其重要的决定因素。有机肥比例和菌剂浓度对菌肥耦合杀虫效果的影响达到极显著水平，油饼比例、有机肥比例和菌剂浓度交互作用对菌肥耦合杀虫效果的影响达到显著水平，有机肥与虫生菌耦合效果影响因子大小为有机肥比例＞菌剂浓度＞油饼比例。相较于对照，在配制一定的生物菌后其防病能力都显著提高，更加说明了增加生防菌营养载体的重要性。曹亮亮等研究同一功能菌株添加不同有机载体制成的生物有机肥时，发现添加膨化羽毛粉制成的生物有机肥不及添加菜粕制成的生物有机肥对香蕉的促生作用显著[15]，这一研究结果给我们的一个重要启示是，在筛选生防菌资源时，应以产品开发为主导，根据不同的有机载体，筛选并获得具有较大潜力的功能菌株。本文通过数学建模分析表明，当有机肥80.5%、油饼14.3%、白僵菌-淡紫紫孢菌组合菌剂8.4%时，对根结线虫防效达到最优，其值为80.5%。