海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多态性与糖尿病视网膜病变关系

吴清静 ，吴佩佩，鲁 晓，彭 立,2 ，邢 球， 谢 青

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是一种常见的致盲眼病，是最严重和最常见的糖尿病微血管并发症之一，已在中老年人群中成为最常见的导致视力损害和不可逆性失明的原因之一[1-2]，DR在糖尿病人群中的患病率大约为三分之一，其中十分之一的人有视力下降，如糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema, DME)或增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy, PDR)。DR发病机制复杂，目前尚无明确一致的发病机制可以解释该疾病的发生发展。DR 的发生发展与糖尿病本身以及患者的血糖控制情况密切相关，此外DR的发生亦具有显著的个体差异和家庭聚集性。有文献报道DR的发生有27%的遗传可能性，PDR患者的遗传性更高，可达52%[3]，DR的发生、发展与遗传因素有着密切的关系。

DR患者的视功能和生存质量随着DR的发展受到严重的影响[4-5]，早期发现高风险的DR患者，早期提供最佳的预防和治疗措施，将极大地改善DR患者的视功能预后与生活质量。临床上DR损害患者视功能的主要原因为视网膜新生血管的生成和黄斑水肿的发生，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在DR新生血管的生成中扮演者重要角色，有着密切的关系[6]。

近几年分子生物学研究得到快速发展，识别早期诊断的生物标志物、预后预测和DR的靶向治疗是非常重要的[7]，关于DR在基因层面的科学研究逐渐增多，不断引起学者的重视，生长因子基因多态性与DR 发生发展的关系研究是当前国内外研究热点，对评价DR的严重程度以及探索新疗法的研究中起着重要的作用，为研究DR新的治疗靶点提供重要的依据和支持。黎族属于少数民族，中国有125万黎族人口，其中111万来自海南[8]，而海南作为中国唯一的热带地区，本地区的人群的基因多态性与DR 相关性的研究鲜有报道，我们旨在探索海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多态性与DR的关系，为早期糖尿病患者的预防、诊断提供有力的依据。

1对象和方法

1.1对象前瞻性研究。随机收集2016-09/2019-10海口市人民医院眼科和内分泌科住院的海南黎族2型糖尿病患者89例，其中男49例，女40例。依据世界卫生组织(WHO)推荐的糖尿病诊断和糖代谢状态分类标准实施。纳入标准：同时满足以下要求：(1)2型糖尿病；(2)祖籍为海南黎族，3代以上父母双方均为海南黎族人；(3)糖尿病病程≥8a；(4)所有患者均接受眼科检查(最佳矫正视力、裂隙灯显微镜+90D非接触镜、眼底照相、OCT、FFA)。排除标准：(1)患有酮症酸中毒、心力衰竭、高血糖高渗性昏迷、脑梗塞急性期、尿毒症(肌酐≥707μmol/L)、妊娠期糖尿病、1型糖尿病者；(2)既往有高血压性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、眼底血管样条纹、中心性浆液性视网膜病变、中心性渗出性脉络膜视网膜病变、息肉状脉络膜血管病变、年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉周围炎、脉络膜新生血管病史者。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，通过海口市人民医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1一般资料收集通过问卷咨询调查、查阅相关病例、进行相关体格检查和实验室检查进行临床各项指标的收集。所有患者禁食12～14h，晨起空腹抽取肘静脉血，应用全自动生化仪测肌酐、尿素、总胆固醇、甘油三酯；低压液相层析柱法(EDTA抗凝全血，EDTA:血量=1.5mg/mL)测糖化血红蛋白(HbA1c)。

1.2.2提取基因组DNA 采集纳入研究对象的EDTA抗凝血3mL，按照实验步骤提取研究对象的基因组DNA。

1.2.3检测基因多态性应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性检测分析法对研究对象提取的样本进行基因多态性检测。引物的设计根据基因序列和相关文献。VEGF基因rs2010963位点PCR扩增全长度为224bp，上游引物为5’-GGATTTTGGAAACCAGCAGA-3’，下游引物为5’-CTGTCTGTCTGTCCGTCAGC-3’。VEGF基因rs3025039位点PCR扩增全长度为317bp，上游引物为5’-GGGAACCAGATCTCTCACCA-3’，下游引物为5’-TGTATGTGGGTGGGTGTGTC-3’。PCR反应体系中含2X Goldstar Buffer Mix 10μL，H2O 6μL，DNA 100ng(≈1μL)，Primer Mix 3μL。将配置好的PCR反应体系液置入PCR检测仪里，按照实验步骤进行下一步的PCR检测。按照实验步骤进行样品的基因测序，随后进行上机电泳，应用ABI 3130/ABI 3130XL测序仪实施样品的测序，对样品的rs2010963、rs3025039位点进行相关检测。

2结果

2.1三组患者临床资料比较参照中华医学会眼底病学组的标准对DR进行分组：非增殖期DR(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)患者30例和增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者33例。将2型糖尿病无视网膜病变(diabetic without retinopathy,DWR)患者26例作为对照。三组患者平均年龄、糖尿病病程、收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三酯、糖化血红蛋白比较差异均无统计学意义(P>0.05)；PDR患者尿素、肌酐水平较DWR和NPDR组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.016667)，见表1。

表1 三组患者临床资料比较

2.2三组患者VEGF基因rs2010963检测结果三组患者均存在CC、CG及GG三种基因型和C、G两种等位基因，见图1。该位点的基因型分布频率与Hardy-Weinberg平衡定律一致。三组患者各基因分布情况见表2。Fisher精确检验结果显示三组患者CC基因型比较差异有统计学意义(P=0.003)，进一步两两比较显示：DWR和NPDR组差异有统计学意义(P=0.014)，NPDR组和PDR组差异无统计学意义(P=0.435)，DWR和PDR组差异有统计学意义(P=0.002)。三组患者CG基因型比较差异有统计学意(χ2=10.046，P=0.006)，进一步两两比较显示：DWR和NPDR组差异无统计学意义(P=0.067)，NPDR组和PDR组差异无统计学意义(P=0.168)，DWR和PDR组差异有统计学意义(P=0.002)。三组患者GG基因型比较差异无统计学意义(χ2=0.230，P=0.893)。三组患者C和G等位基因分布比较差异均无统计学意义(χ2=3.384，P=0.184;χ2=3.384，P=0.184)，见表2。结果提示CC基因型增加PDR的易感性。

图1 海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963位点各基因型测序图 A：CC基因型；B：CG基因型；C:GG基因型。

表2 三组患者VEGF基因rs2010963基因型及等位基因分布比较n(%)

2.3三组患者VEGF基因rs3025039位点检测结果三组患者均存在C、T两种等位基因和CC、CT两种基因型，NPDR和PDR组还存在TT基因型，见图2。三组患者VEGF基因rs3025039基因型及等位基因分布比较见表3。

图2 海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs3025039位点各基因型测序图 A：CC基因型；B：CT基因型；C:TT基因型。

表3 三组患者VEGF基因rs3025039基因型及等位基因分布比较n(%)

Fisher精确检验结果显示，三组患者CC、CT、TT基因型比较差异均无统计学意义(P=0.835、0.950、0.773)。三组患者C和T等位基因分布比较差异均无统计学意义(χ2=1.028，P=0.598；χ2=1.028，P=0.598)。

2.4三组患者不同基因型与PDR发生率的比较与基因型为TT的研究对象相比，等位基因C携带者患PDR的危险性较高[82%(54/66)vs6%(2/33)]。

3讨论

本研究采用PCR结合DNA测序法方法首次对中国海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963和rs3025039的单核苷酸多态性进行研究。以上两个单核苷酸位点在VEGF的转录及翻译过程中起着不容忽视的重要作用，但因种族、地区及生活方式的不同，它们与DR的相关性存在较大差异。海南岛地理位置特殊，有独特的海洋气候，黎族是海南的土著居民，历代多居住于山地及丘陵地带，缺乏与外界交流，再加上相对封闭保守的婚恋原则，与外族人通婚较少，导致黎族基因具有其保守性和独特性，目前鲜有黎族人群的相关报道。单核苷酸多态性的研究较多[9]，是人类最常见的遗传变异形式，估计占人类遗传变异的90%以上，是当基因组序列中的单个核苷酸发生改变时所发生的DNA序列变异，在多种人类疾病的发生发展中起着重要作用[10]。VEGF是一种有效的血管生成和血管通透性因子，其多态性与DR的发生发展相关[11]。

Watson等[12]对英国健康人群进行研究发现VEGF基因单核苷酸多态性与VEGF蛋白表达有关，其中rs2010963位点携带G等位基因可使VEGF基因转录增强，从而使VEGF蛋白浓度增加。且携带GG基因型的个体血浆VEGF含量最高，CG基因型次之，CC基因型的含量最低。rs2010963中的CC基因与VEGFA分泌减少有关[13]。我们的研究结果显示，DWR组、NPDR组与PDR组中均存在CC、CG及GG三种基因型和C、G两种等位基因。三组中CC基因型分布频率分别约为4%、30%和39%，CG基因型频率分别为58%、33%、和18%，GG基因型分布频率依次是38%、37%和42%。与DWR相比，PDR组CC基因型频率显著增高，CG基因型明显降低，NPDR组CG基因型略降低。在海南黎族2型糖尿病患者中，rs2010963位点的CC基因型增加PDR的易感性。我国学者Yuan等[10]对河北石家庄地区的汉族2型糖尿病患者进行基因位点研究发现NPDR组、PDR组与无DR组在rs2010963位点的基因型和等位基因分布频率上无显著差异。文献报道对中国台湾地区糖尿病患者进行基因检测发现携带CC或CG基因型的患者的DR患病率明显高于携带GG基因型患者，且C等位基因患者中VEGF的表达水平增高[14]。伊朗学者Fegghi等[15]研究发现在rs2010963位点GG基因型是PDR患者的独立危险因素，携带GG基因型患PDR的概率为携带CC基因型的1.87倍。韩国的一项研究显示，韩国2型糖尿病人群中PDR、NPDR、DWR在rs2010963位点上各基因型及等位基因上无明显差异[16]。文献报道CC基因型在DWR组中比例最高，而GG基因型则在PDR组中比例最高，差异具有统计学意义[17]。rs2010963在其他疾病中也被报道过，如冠状动脉疾病发生风险相关[18]，与先兆子痫发生风险有显著的相关性[19]。rs2010963位点与VEGF基因的激活蛋白-1紧密连接，参与VEGF蛋白产物的表达[20]，且还有研究发现它可以改变VEGF基因启动子的反应活性[21-22]。不同地区的人群，不同的民族群体间在rs2010963存在多态性。VEGF的增加导致PDR的发生，视网膜缺血是VEGF分泌的主要刺激因子，导致PDR[23]。

rs3025039位点可通过激活蛋白-4发挥作用，调节血浆VEGF水平[24-25]。这些位点的多态性都可能影响VEGF的转录水平或表达水平，与DR的发生、发展密切相关。一项Meta分析显示在等位基因模型中发现rs3025039(C>T)多态性与DR风险增加显著相关[26]。我们的研究显示三组之间rs3025039在等位基因分布方面差异无统计学意义，但是NPDR和PDR组还存在TT基因型，黎族2型糖尿病患者患者在rs3025039位点单核苷酸多态性与DR的发生相关性不显著，可能与我们的人群特性有关。此外，不同的DME患者个体对抗VEGF治疗的反应并不相同，DME抗VEGF治疗反应的个体间差异可能部分是由于VEGF基因的多态性和/或VEGF基因表达的差异所致[27]。因此，VEGF的单核苷酸多态性可能在DR的发生与发展中起着重要作用，VEGF基因的多态性可能在抗VEGF的治疗反应中起到决定性作用。

在国内海南黎族的人群中，rs2010963和rs3025039尚未被报道过。本研究也存在局限性，首先我们的研究样本量有限，可能不能完全评估基因的多态性情况，其次虽然我们首次对海南黎族人群进行了研究，但是缺少大样本的和汉族人群的对比研究。

综上所述，海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963位点的CC基因型较CG基因型增加糖尿病患者DR的易感性，海南黎族DR患者主要为CC基因型。而在rs3025039位点上，黎族NPDR和PDR组还存在TT基因型，在rs3025039位点单核苷酸多态性与DR的发展相关不显著。本研究运用PCR-RFLP技术测定VEGF基因型，探索海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多态性与DR的相关性，探寻DR发生的遗传学证据，为早期预防、诊断提供有力的依据，期望能为DR提供更有效的治疗手段。