朝鲜蓟副产物超微粉强化茶饮料的功能性成分研究

范卓妍，班龄尹，黄 威，倪元颖，李景明*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京 100083 2 香飘飘食品股份有限公司 浙江湖州 310042）

朝鲜蓟（Cynara scolymus L.）是菊科菜蓟属多年生草本植物，在巴西、意大利、法国、美国南部、南美洲和中国等地广泛种植。朝鲜蓟的可食部分是未成熟的头状花序，不仅含有丰富的营养成分，还富含生物活性化合物[1-3]，是一种具有保健功效的药食同源植物，被誉为“蔬菜之皇”，具有降血脂，抗氧化，缓解肝胆疾病及消化不良等生理功能[4-9]。基于朝鲜蓟本身丰富的营养成分和功能活性成分，有很多研究将其添加到食品中制备功能性食品，如朝鲜蓟茶、朝鲜蓟酸奶、朝鲜蓟啤酒等[10-12]。通常将内部苞片和花托视为朝鲜蓟的可食部分，其仅占总生物量的15%～20%，其余部分均变为工业副产物，于是产生大量废弃物，造成巨大的环境压力及资源浪费[13]。事实上，朝鲜蓟的非食用部分，如茎、叶等，也含有多酚、萜类和甾醇等多种活性化合物[3，14-16]。例如：朝鲜蓟叶作为一种具有广谱药理作用的药用植物，一直被用于治疗各种疾病[17]。朝鲜蓟的茎叶等副产物可能作为功能性食品中功能活性成分的良好来源。此外，开发资源丰富的朝鲜蓟等植物副产物中的功能活性成分，将有效缓解环境压力和药用植物资源压力，促进人类健康和环境可持续发展。

奶茶兼具牛奶和茶的双重营养，因其美味可口、时尚休闲、方便快捷等特点，而深受广大消费者的喜爱。近年来，人们对食品的营养和功能性越来越重视。超微粉碎技术作为在食品加工中被广泛应用的技术，可使食品物料经过超微粉碎后具有很强的吸附性、流动性，提高食品中各成分的溶解度和化学反应速度，同时可以更好地保留原料中的生物活性物质，改善食品的口感，并避免了天然成分在提取工艺中存在的溶剂残留等食品安全隐患，可同时提高食品的应用功能性和安全性[18-19]。本研究采用超微粉碎技术，将朝鲜蓟茎叶副产物加工为超微粉，并将其添加至抹茶奶茶中，制备营养强化型奶茶。利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）和高效液相色谱-三重四极杆串联质谱技术（HPLC-QqQ-MS/MS）检测奶茶中的酚酸化合物、黄酮类化合物、五环三萜类及甾醇等功能活性成分。为朝鲜蓟副产物的开发利用及营养强化食品或功能性食品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

朝鲜蓟的茎叶副产物，中国云南省曲靖市陆良县中枢镇华侨农场 （103.705089°E，25.024768°N），采收后及时降温至15 ℃以下，随后进行分拣，清洗，并切分为5 cm 小段，冷冻干燥。冻干后的样品立即进行超微粉碎，加工之后的朝鲜蓟副产物超微粉置于-20 ℃冰箱中保存。

白砂糖、抹茶粉、脱脂奶粉均为市售。单脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、D-异抗坏血酸钠、三聚磷酸钠，北京金瑞林科技有限公司。

甲醇（色谱级），北京百灵威科技有限公司；正构烷烃（C7～C40），上海安普实验科技股份有限公司；正十六烷，吡啶（纯度均大于99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三甲基氯硅烷（纯度大于99%）、N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（纯度大于96%）、二氯甲烷（分析纯），上海麦克林生化科技有限公司。

标准样品：咖啡酸（Caffeic acid）、香草酸（Vanillic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、木犀草素（Luteolin）、绿原酸（Chlorogenic acid）、柚皮素-7-O-芸香糖苷（Narirutin）、丁香酸（Syringic acid）、洋蓟素（Cynarin）、芹菜素（Apigenin）、原儿茶酸（Protocatechuic acid）、对香豆酸（p-Coumaric acid）、对羟基苯甲酸（p-Hydroxybenzoic acid），纯度均大于98%，美国Sigma-Aldrich 公司；菜蓟苦素 （Cynaropicrin）（纯度大于96.4%）、豆甾醇（Stigmasterol）（纯度 98%）、β-谷甾醇 （β-Sitosterol）（纯度大于 95%）、羽扇豆醇（Lupeol）（纯度98%），天津阿尔塔科技有限公司；α-香树脂醇（α-Amyrin）（纯度≥98%）、β-香树脂醇 （β-Amyrin）（纯度≥98%），美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

6890N/5973 气相色谱-质谱联用仪（配以DB-5 J＆W 毛细管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），美国安捷伦科技公司；Waters I-class 型液相色谱串联Xevo TQ-s micro 型三重四极杆质谱（配以 ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱，1.7 μm，2.1 mm × 100 mm），美国Waters 公司；CFJ-400 中药粗粉机，北京永恒鑫盛科技发展中心；HMB-400 超微粉碎机，京环亚天元机械技术有限公司；GL-2OG-II 型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；FD-1A-50 冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 HPLC-QqQ-MS/MS 方法检测多酚化合物的色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）。流动相A：水＋0.1%甲酸，流动相B：乙腈，流速0.3 mL/min，柱温45 ℃，进样量5 μL，洗脱条件：0～1 min，2%B；1～3 min，2%～10%B；3～10 min，10%～28%B；10～13 min，28%～60%B；13～15 min，60%～80%B；15～16 min，80%～98%B；16～17 min，98%B；17～17.1 min，98%～2%B；17.1～19 min，2%B。

1.3.2 HPLC-QqQ-MS/MS 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），负离子模式，毛细管电压2.5 kV，锥孔电压28.5 V，锥孔气流量10 L/H，脱溶剂气流量1 100 L/H，源温度150 ℃，脱溶剂气温度550℃，采用分段扫描的方式。

1.3.3 GC-MS 方法检测萜类化合物的色谱条件DB-5 J＆W 毛细管柱30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），载气为高纯氦气（41 cm/s）。采取自动进样，含有五环三萜类及甾醇类化合物的提取物进样量为1 μL，进样口温度270 ℃，分流比30∶1；柱温箱的升温程序：初始温度120 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 的速度升至250 ℃，而后以2 ℃/min 的速度升至285 ℃，并保持15 min。

1.3.4 GC-MS 质谱条件 采用离子碰撞模式，离子能量为70 eV，以全扫描模式进行信息采集，扫描范围为m/z 30～600，离子源温度230 ℃。

1.3.5 奶茶样品的制备 配制抹茶奶茶粉和朝鲜蓟副产物超微粉抹茶奶茶粉，并参考《RHB 202-2004 脱脂乳粉感官评鉴细则》对配制的奶茶进行感官质量评价[20]，最终确定两种奶茶粉配方如表1所示。准确称取两种奶茶粉各2 g，各加入85 ℃以上热水8 mL 并进行旋涡混匀，即制得两种奶茶。

表1 奶茶粉配方Table 1 The formulas of milk tea

1.3.6 多酚化合物的提取 参照Rouphael 等[21]、Jin 等[22]的方法并稍作修改。取1.3.5 节中制得的两种奶茶各1 g，用70%的色谱级甲醇进行稀释并在冰水浴中超声提取30 min，在4 ℃条件下，10 000 r/min 离心10 min，取上清液。利用样品沉淀再次提取，合并2 次上清液，用70%甲醇定容至25 mL。重复提取3 次。检测前经0.22 μm 微孔滤膜过滤后转入1.5 mL 进样瓶中进样分析。

1.3.7 萜类化合物的提取和衍生处理 参考Ramos 等[16]、Markus 等[23]的方法并稍作修改。取1.3.5 节中制得的两种奶茶各5 g，加入125 mL 二氯甲烷，磁力搅拌萃取24 h 后离心取上层提取液。利用旋转蒸发仪在50 ℃下对提取液进行低压干燥，旋蒸后加入二氯甲烷对干燥后的提取物进行复溶，定容至25 mL，取1 mL 氮吹至彻底干燥。重复提取3 次。参考Ramos 等[16]的方法，在进行GC-MS 检测之前，先对萜类化合物提取物进行三甲基硅烷化（TMS）衍生。在氮吹干燥后的脂溶性提取物中加入250 μL 含1 mg 正十六烷的吡啶，待提取物完全溶解后，加入250 μL 的N，O-双（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺和50 μL 的三甲基氯硅烷，混合物于70 ℃反应30 min。

1.3.8 多酚化合物的定性与定量分析 多酚化合物的检测根据标准物质或文献中物质的质谱信息进行定性，通过标准物质进行定量分析，或采用结构相近的多酚化合物的标准物质进行定量分析。

1.3.9 萜类化合物的定性与定量分析 萜类化合物根据标准物质或文献中物质的质谱信息进行定性分析，并通过标准物质或正十六烷进行定量分析，结果均折算为样品中物质的含量。

1.4 数据分析

使用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 5 对数据进行统计分析。采用Duncan's test 进行方差分析（Analysis of variance，ANOVA），显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 奶茶中多酚化合物的鉴定

根据标准物质和文献中物质的质谱信息（表2）对奶茶中的多酚化合物进行定性分析。在两种奶茶中共检测出17 种多酚类化合物，其中包括12 种酚酸类化合物和5 种黄酮类化合物（表2）。

表2 奶茶提取物中多酚化合物成分鉴定Table 2 Identification of polyphenols in milk tea extract

2.2 多酚化合物的检出限、定量限及线性方程

表3为12 种多酚化合物标准样品的检出限、定量限及线性方程。在相应的线性范围内，每种多酚化合物标准样品的浓度与峰面积线性关系良好，可以通过相应的标准曲线对各种多酚化合物进行定量。其中，1-O-咖啡酰奎宁酸根据绿原酸的标准曲线进行定量，3，4-O-二咖啡酰奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸根据洋蓟素的标准曲线进行定量，木犀草素-7-O-葡糖苷酸根据木犀草素的标准曲线进行定量，芹菜素-7-O-葡糖苷酸根据芹菜素的标准曲线进行定量。图1为咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸及它们的同分异构体的总离子流出图。

表3 不同多酚化合物的检出限、定量限及线性方程Table 3 The limit of detection （LOD） and limit of quantification （LOQ） and linear equation of polyphenols

图1 咖啡酰奎宁酸、二咖啡酰奎宁酸及它们的同分异构体的总离子流出图Fig.1 Total ion chromatography of caffeinylquinic acid，dicaffeoylquinic acid and their isomers

2.3 添加朝鲜蓟副产物超微粉对奶茶中多酚化合物的影响

对奶茶中的多酚化合物的定量分析发现，添加朝鲜蓟茎叶副产物超微粉后，奶茶中的咖啡酰奎宁酸化合物、咖啡酸、原儿茶酸、洋蓟素、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸等12 种酚酸类化合物的含量显著升高（P＜0.05）（图2）。此外，添加朝鲜蓟茎叶副产物超微粉显著增加了奶茶中5 种黄酮类化合物的含量（P＜0.05）（图3），如柚皮素-7-O-芸香糖苷、木犀草素和芹菜素及其糖苷衍生物。以上结果表明，在食品中添加朝鲜蓟茎叶副产物超微粉可丰富食品中的功能活性多酚成分。

图2 添加朝鲜蓟副产物超微粉对奶茶中酚酸类化合物的影响Fig.2 Effects of superfine powder of artichoke by-products on phenolic acids in milk tea

图3 添加朝鲜蓟副产物超微粉对奶茶中黄酮类化合物的影响Fig.3 Effects of superfine powder of artichoke by-products on flavonoids in milk tea

2.4 奶茶中萜类化合物的鉴定

表4是对倍半萜内酯和五环三萜两种萜类化合物进行三甲基硅烷化衍生后的电子轰击源质谱（EI-MS）信息。图4与图5分别为萜类化合物标准物质和奶茶中萜类化合物的总离子流出图。本研究共鉴定了10 种萜类化合物，其中包括3 种倍半萜内酯、2 种甾醇及5 种五环三萜化合物 （表5）。

图4 萜类化合物标准品的总离子流出图Fig.4 Total ion chromatography of standards for terpenoids and sterols

图5 奶茶提取物中萜类化合物的总离子流出图Fig.5 Total ion chromatography of standards for terpenoids and sterols in milk tea

表4 萜类化合物（倍半萜内酯和五环三萜类物质）在TMS 衍生后的EI-MS 信息[16]Table 4 Electron impact mass spectra （EI-MS） of the sesquiterpene lactones and the pentacyclic triterpenes identified in the form of TMS derivatives[16]

表5 奶茶中萜类化合物成分鉴定Table 5 Identification of terpenoids and sterols in extract of milk tea

2.5 添加朝鲜蓟副产物超微粉对奶茶中萜类化合物的影响

对奶茶中萜类化合物的检测结果显示，添加了朝鲜蓟副产物超微粉后，奶茶中的倍半萜内酯、甾醇、五环三萜类化合物的含量均显著升高（P＜0.05），如表7所示。且在抹茶奶茶对照组中，未检测到大海米菊素、菜蓟苦素、豆甾醇、羽扇豆醇、ψ-蒲公英甾醇和蒲公英甾醇，说明在抹茶奶粉中几乎不含有这几种萜类物质。而添加朝鲜蓟副产物超微粉后，奶茶中各类萜类化合物的含量都显著增加，赋予奶茶更全面的营养功能活性。

3 讨论

多酚和萜类化合物属于植物次生代谢产物，除具有重要的生物学和生态学意义外，这些次生代谢产物还具有广泛和高效的药用价值，尤其是抗炎和抗氧化作用，是药用植物的重要有效成分[26-28]。目前，针对朝鲜蓟中活性成分及其功能性的研究多关注于朝鲜蓟中的多酚类物质[29-32]。Lombardo 等[1]研究朝鲜蓟的不同部位中的多酚化合物，在检测到的19 种多酚化合物中，芹菜素-7-O-葡糖苷酸是主要的类黄酮，绿原酸是主要的咖啡酰奎宁酸，这与本研究的结果类似（图2和图3）。事实上，在朝鲜蓟生长发育过程中，酚类化合物往往聚集在外部苞片和茎叶等外围部分。这可能与其作为植物体内主要的次生代谢产物，在植物生长发育、环境适应、抵御病虫害等方面发挥重要作用相关。本研究利用HPLC-QqQ-MS/MS 对奶茶进行检测分析，确定了添加朝鲜蓟茎叶副产物的奶茶中的多酚含量显著增加，其中主要的多酚为酚酸类化合物和黄酮类化合物。

除多酚类化合物外，朝鲜蓟副产物中还富含萜类化合物[16，34-35]。萜类化合物具有较强的抗氧化、抗炎、抗癌等生理活性[36]。本研究利用GC-MS在添加朝鲜蓟茎叶副产物的奶茶中检测到10 种萜类化合物，其中倍半萜内酯、甾醇、五环三萜类化合物分别增加了2 种、1 种和3 种。同时添加朝鲜蓟茎叶副产物，在极大程度上提高了奶茶中功能性萜类化合物的含量（表6）。

表6 添加朝鲜蓟副产物超微粉对奶茶中萜类化合物含量的影响Table 6 Effects of ultra-fine powder of artichoke by-products on the terpenoids in milk tea

本研究将冻干后的朝鲜蓟茎叶副产物加工成超微粉，以15%的添加量添加至抹茶奶茶中，获得具有良好感官品质的奶茶产品。朝鲜蓟副产物中富含的多酚类物质、萜类化合物等功能活性成分得以安全、高效地转移到奶茶产品中，同时促进朝鲜蓟副产物的开发利用，满足市场对营养强化功能食品的消费需求。

4 结论

朝鲜蓟茎叶副产物含有较丰富的多酚和萜类化合物。本研究将朝鲜蓟茎叶副产物超微粉添加于抹茶奶茶中，制备营养强化奶茶。结果表明，朝鲜蓟副产物超微粉显著增加了奶茶中12 种酚酸类化合物和5 种黄酮类化合物的含量；丰富了奶茶中萜类化合物的组成。朝鲜蓟副产物超微粉赋予奶茶丰富的多酚和萜类物质成分，为朝鲜蓟副产物超微粉作为一种良好的天然功能性成分来源应用于现代食品加工提供依据。