固相萃取法联用UPLC-Triple-TOF/MS法鉴定花菜中自由和结合态植物甾醇

冯思敏，吴思杰，江佳萍，廖 杰，孙培龙，2，邵 平，2*

（1 浙江工业大学食品科学与工程学院 杭州 310014 2 中国轻工业食品大分子资源加工技术研究重点实验室（浙江工业大学） 杭州 310014 3 浙江华才检测技术有限公司 浙江绍兴 311800）

花菜（Brassica oleracea L.var.botrytis L.），又名花椰菜、菜花、洋花菜，为十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种[1]。其适应性强，在我国分布广泛，主要集中于福建、浙江、江苏等沿海地区，以及河北、云南等地区[2]。花菜中含有丰富的维生素、碳水化合物、矿物质等营养成分，以及萝卜硫素[3]、多酚、芥子油苷[4]、植物甾醇[5]等生物活性物质，具有较高的营养价值。

植物甾醇（Phytosterol）是一类以环戊烷多氢菲为骨架的天然活性物质[6]，其结构与胆固醇相似，然而功能完全不同，广泛存在于各种植物油、坚果及其它植物性食物中。Han 等[7]发现蔬菜中总植物甾醇含量为1.1～53.7 mg/100 g，其中最高浓度出现在豌豆、花椰菜、西兰花和生菜中。在已报道的200 多种植物甾醇中，谷甾醇、豆甾醇、麦胶甾醇最为常见。有研究表明，植物甾醇具有降低胆固醇[8]、抗肿瘤[9]、抗炎[10]、抗氧化[11]等功效，Feng 等[12]指出植物甾醇能调节胆固醇、脂肪酸、TG 和BA，从而缓解非酒精性脂肪肝、炎症性肠病和肥胖症等不同疾病。由此可见，植物甾醇在疾病防治方面具有重要作用，使其在医学、生命科学、食品等领域日益受到重视，具有广阔的开发前景。然而植物甾醇结构较复杂，国内对该领域的研究与开发较国外相对滞后，用于分析不同类型、形态植物甾醇的方法尚不完善[13]，尚需深入研究。

甾醇的生理活性可能受其结构的影响[14]。为进一步扩大植物甾醇在食品、医药、化妆品等领域的应用，对其纯度应有更高的要求。对不同形态植物甾醇的分离、纯化，定量、定性分析以及结构鉴定，具有重要意义。本研究采用固相萃取法（SPE）分离花菜中4 种结合状态的植物甾醇，用超高效液相色谱串联三重四极杆飞行时间质谱 （UPLCTriple-TOF/MS）鉴定其甾醇的种类，分析其结构，为进一步研究花菜及其它蔬菜中植物甾醇提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花菜，当地农贸市场，热风干燥后粉碎待用。

异丙醇（特级色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正己烷（特级色谱纯）、乙腈（特级色谱纯），天津市四友精细化学品有限公司；Silica固相萃取柱（500 mg/3 mL），Phenomenex 公司；Diol固相萃取柱 （500 mg/3 mL），GL Sciences Inc 公司；其余化学试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

AY220 型电子天平，日本岛津公司；AcquityTM ultra 型超高效液相色谱仪，美国Waters公司；Triple TOF 5600+三重四极杆-高分辨飞行时间质谱仪 （配有大气压力化学电离源），美国ABSCIEX 公司；752N 紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；RE-2000A 真空旋转蒸发仪，上海研承仪器有限公司；miVac 真空离心浓缩仪，英国GeneVac 公司；GZX-9076MBE 电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；CR21N 高速冷冻离心机，日本日立工机株式会社；FS-1200pv 超声波处理器，上海生析超声仪器有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅，江苏国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制 配制豆甾醇标准溶液：称取100.0 mg 豆甾醇标样，加入适量无水乙醇，溶解后定容至100 mL。准确吸取10 mL 并用无水乙醇定容至100 mL，此时的溶液作为标准液。

配制磷硫铁显色剂：准确称取10 g 三氯化铁（Ⅲ）六水合物，加入适量浓磷酸（85%），溶解后定容至100 mL。吸取1.5 mL 上述溶液于100 mL 棕色容量瓶，用浓硫酸定容。

称量100.0 mg 豆甾醇标样，加入适量无水乙醇，溶解后定容至100 mL。使用时取10 mL，用无水乙醇定容至100 mL，此时的溶液作为标准液。分别吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 标准液于试管，加入无水乙醇补充至4 mL，再加入2 mL 磷硫铁显色剂显色15 min，于520 nm 波长下测定吸光度，以豆甾醇含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得到回归方程y=0.063x-0.0066，R2=0.9965，表明豆甾醇质量浓度在0～62.5 μg/mL内线性关系良好。

1.3.2 花菜中植物甾醇的提取及总甾醇含量的测定 称取500 mg 花菜粉，各加入2.5 mL 氯仿和甲醇，摇匀，超声20 min，过滤，将滤液转移至圆底烧瓶，45 ℃旋蒸至干，复溶于10 mL 无水乙醇。取1 mL 样品溶液和3 mL 无水乙醇于试管中，按上述方法测其吸光度，得到总甾醇含量。

1.3.3 固相萃取法分离植物甾醇

1.3.3.1 游离甾醇、甾醇酯和酰化甾醇糖苷、甾醇糖苷分离 准确称取花菜粉1.000 g，加入各5 mL 氯仿和甲醇，提取方法如上所述，45 ℃旋蒸，加1 mL 氯仿复溶。硅胶柱中加入5 mL 氯仿活化，上样1 mL，先用氯仿洗脱游离甾醇（FS）和甾醇酯（SE），干燥后，加入1 mL 己烷复溶；再加入丙酮-异丙醇（体积比1∶1）洗脱酰化甾醇糖苷（ASG）和甾醇糖苷（SG），干燥后，加1 mL 庚烷-异丙醇（体积比95∶5）复溶。

1.3.3.2 洗脱 硅胶柱中加入5 mL 己烷活化，将

1.3.3.1 节中的第1 个洗脱组分加入柱内，先用己烷-乙醚（体积比99∶1）洗脱SE，再加入己烷-乙醚（体积比85∶15）洗脱FS。

Diol SPE 柱（500 mg，3 mL）加入5 mL 庚烷活化，将1.3.3.1 节中的第2 个洗脱组分加入柱内，庚烷-异丙醇（体积比97∶3）洗柱后，先加入庚烷-异丙醇（体积比92∶8）洗脱ASG，再加入庚烷-异丙醇（体积比85∶15）洗脱SG。

分别用3，4，5，6，7，8 mL 的溶剂按照上述流程洗脱甾醇。

1.3.3.3 各组分甾醇含量的测定 按1.3.2 节的方法测定吸光度，记录分析不同体积洗脱液对甾醇洗脱量的影响。

1.3.4 UPLC-Triple-TOF/MS 检测分析

1.3.4.1 超高效液相色谱条件 色谱柱：Agilent eclipseplus C18 柱 （4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相A：90%甲醇，B 相：乙腈-异丙醇（体积比1∶1）；流速：0.6 mL/min；检测器：紫外可见光；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相梯度洗脱见表1。

表1 液相梯度洗脱条件Table 1 Liquid gradient elution conditions

1.3.4.2 质谱条件 扫描方式：正离子模式（AP-CI），一级全扫描，加自动二级扫描；电喷雾电压：+5.5 kV；扫描范围：m/z 100～1 000；离子源温度：600 ℃；辅助气Gas1 压力：344.75 kPa；辅助气Gas2 压力：344.75 kPa；最大允许误差：±5 ppm 范围内；去簇电压（DP）：100 V；聚焦能量：10 V。

1.4 数据统计与分析

除液质分析外，试验所得数据结果采用2 次及以上平行试验，数据表示方法为“平均值±标准差”。使用Peakview 软件进行质谱图分析鉴定，使用Origin 2019 进行数据处理及分析，使用Chem-Draw Professional 17 绘制甾醇结构式。

2 结果与分析

2.1 花菜中总甾醇含量

甾醇提取液与磷硫铁试剂显色反应后，在520 nm 紫外光波长下测吸光度，结果取平均值，总甾醇含量为（5.034±0.097）mg/g，RSD=1.733%。

2.2 SPE 不同体积洗脱液对甾醇洗脱量的影响

由图1（a，b）可知，SE 洗脱量随着洗脱液体积增加呈先增加后稳定的趋势，在5～6 mL 内，洗脱量显著增加（P＜0.05），6 mL 后随着洗脱液体积增加，SE 洗脱量无明显变化（P＞0.05）；FS 洗脱量在洗脱液体积小于5 mL 时呈下降趋势，6 mL 时洗脱量显著增加（P＜0.05），在7 mL 时又下降。通过FS 和SE 图像对比分析可知，洗脱液体积小于5 mL 时，SE 未完全洗脱，导致FS 洗脱液中SE 的存在。由此可以解释5 mL 之前FS 洗脱量随洗脱体积增加而下降，在6 mL 之后SE 洗脱量没有发生明显上升，说明在6 mL 左右SE 已洗脱完全，则可将6 mL 定为SE 的最佳洗脱体积，计算此时SE的洗脱量为（334.69±18.09）μg。而FS 洗脱量在6 mL 时出现一个峰值，可将6 mL 定为FS 的最佳洗脱体积，此时FS 的洗脱量为（695.64±31.50）μg。

由图1（c，d）可知，ASG 的洗脱量随着洗脱液体积的增加，在6 mL 处出现最大值，在4～5 mL内，洗脱量显著增加（P＜0.05），洗脱液体积大于6 mL 后，洗脱量差异不显著（P＜0.05）；SG 的洗脱量在洗脱液体积为3～5 mL 时显著减少（P＜0.05），5～6 mL 时上升，且之后差异不显著（P＞0.05）。通过ASG 和SG 图像对比分析可得，洗脱液体积小于6 mL 时ASG 未完全洗脱，导致SG 中混有ASG，ASG 洗脱量在6 mL 之后变化不大，可认为此时ASG 已洗脱完全，可取6 mL 为其最佳洗脱体积，此时ASG 洗脱量为（1 856.69±38.22）μg。SG 在洗脱液体积为5 mL 时洗脱量最少，5～6 mL 时开始上升，此时应是SG 逐步洗脱的表现，在7 mL 后洗脱量基本不变，可将7 mL 定为其最佳洗脱条件，此时SG 洗脱量为（828.66±32.78）μg。

图1 洗脱液体积对SE（a）、FS（b）、ASG（c）、SG（d）洗脱量的影响Fig.1 Effects of eluent volume on the elution amount of SE （a），FS （b），ASG （c） and SG （d）

2.3 UPLC-Triple-TOF/MS 分析结果

2.3.1 花菜中植物甾醇总离子流色谱图及解析 花菜中4 种结合状态的甾醇经UPLC-Triple-TOF/MS 分析检测，总离子流图见图2。分析图中各峰，并结合文献中各甾醇二级质谱的特点，筛选出丰度较高且可能是甾醇母离子的离子进行检索，最后通过精确分子质量与实测质荷比的对比，对误差范围在±5 ppm 以内的分子式进行筛选。经筛选得到4 个游离甾醇峰（图2a），1～4 分别为豆甾醇、菜油甾醇、羽扇豆醇、β-谷甾醇；3 个甾醇酯峰（图2b），1～3 分别为菜油甾醇亚油酸酯、豆甾醇油酸酯、β-谷甾醇油酸酯。2 个甾醇糖苷峰（图2c），1～2分别为菜油甾醇葡萄糖苷、β-谷甾醇葡萄糖苷。5个酰化甾醇糖苷峰（图2d），1～5 分别为菜油甾醇葡萄糖苷棕榈油酸酯、菜油甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯、豆甾醇葡萄糖苷亚麻酸酯、β-谷甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯、β-谷甾醇葡萄糖苷亚麻酸酯。

图2 花菜中甾醇UPLC-Triple-TOF/MS 总离子流色谱图Fig.2 UPLC-Triple-TOF/MS total ion current chromatogram of phytosterols from cauliflower

2.3.2 游离甾醇（FS）质谱解析 FS 各峰具体信息见表2，对应的二级质谱图如图3所示，分析图中碎片离子峰，并与相关文献比对，得到其结构式。对化合物1 的[M+H-H2O]+离子峰m/z 395.3368 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 121.1012，m/z 147.1163，m/z 161.1325，m/z 175.1474，m/z 257.2260，m/z 297.2565，m/z 353.3215，m/z 379.3372，m/z 395.3668 等碎片离子峰（图3a），根据相关文献[15]，与豆甾醇裂解规律相符，因此推断化合物1为豆甾醇（C29H48O）。Mo 等[16]选择[M+H-H2O]+的一个丰富的产物离子作为定量剂，除油菜素甾醇和豆甾醇分别从C17 侧链上除去84 和98 个质量单位形成m/z 297 产物离子外，大多数片段离子是通过切割甾醇C 环形成，还检测到m/z 161 的产物离子，对应于油菜素甾醇和豆甾醇的碳环断裂。对化合物2 的[M+H-H2O]+离子峰m/z 383.3668 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 109.1017，m/z 133.1011，m/z 147.1165，m/z 161.1325，m/z 173.1325，m/z 215.1796，m/z 243.2097，m/z 287.2738，m/z 383.3668 等碎片离子峰（图3b），参考相关文献[14，16]，其裂解规律与菜油甾醇一致，因此推断化合物2为菜油甾醇（C28H48O）。对化合物3 的[M+H-H2O]+离子峰m/z 409.3822 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 109.1015，m/z 121.1013，m/z 137.1319，m/z 149.1321，m/z 163.1476，m/z 175.1484，m/z 245.2257，m/z 259.2412，m/z 353.3205，m/z 409.3822 等碎片离子峰（图3c），其裂解规律与羽扇豆醇相符，因此推断化合物3 为羽扇豆醇（C30H50O）。Khatal 等[17]研究发现，在APCI 阳离子模式下，羽扇豆醇在m/z 409.5 处有一基峰[M+H-H2O]+，二级质谱显示m/z 137.3 是一个突出的产物离子。对化合物4 的[M+H-H2O]+离子峰m/z 397.3821 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 133.1018，m/z 135.1165，m/z 147.1173，m/z 203.1791，m/z 215.1793，m/z 243.2105，m/z 255.2100，m/z 287.2723，m/z 397.3821 等碎片离子峰（图3d），其裂解规律与β-谷甾醇一致[16]，因此推断化合物4 为β-谷甾醇（C29H50O）。

表2 FS 一级质谱图表Table 2 FS first-order mass spectrometry chart

图3 FS 各峰二级质谱图Fig.3 Secondary mass spectrogram of each peak of FS

2.3.3 甾醇酯（SE）质谱解析 甾醇酯在APCI 正离子模式下形成[M-FA+H]+碎片离子[18]，可通过甾核母离子[M-FA+H]+的质荷比，区分不同甾醇核的酯。对化合物1 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 109.1017，m/z 133.1011，m/z 135.1169，m/z 147.1167，m/z 189.1644，m/z 203.1787，m/z 243.2105，m/z 257.2261，m/z 281.2482，m/z 301.2899，m/z 383.3671，m/z 663.6085 等碎片离子峰（图4a），m/z 383.3671为菜油甾醇特征峰，m/z 281.2484 为亚油酸（C18H32O2）特征峰，m/z 663.6085 为分子离子峰，根据相关文献[19]，与菜油甾醇亚油酸酯分子质量理论值相当，因此推断化合物1 为菜油甾醇亚油酸酯（C46H78O2）。Rocha 等[20]采用ESI-MS 和串联质谱对菜籽油中的甾醇酯进行分析，质谱结果显示SE的铵加化合物（[M+NH4]+）是基峰，串联质谱显示了[（M+NH4）-NH3]+（m/z 663.7）片段的形成，特别是甾醇片段离子[（M+NH4）-NH3-FA]+（m/z 383.4）的形成，可鉴定该化合物为18∶2-菜油酯。对化合物2 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 105.0704，m/z 147.1161，m/z 187.1481，m/z 189.1632，m/z 203.1788，m/z 243.2102，m/z 255.2110，m/z 283.2644，m/z 363.3059，m/z 395.3674，m/z 677.6236 等碎片离子峰 （图4b），m/z 395.3674 为豆甾醇特征峰，m/z 283.2644 为油酸（C18H34O2）特征峰，m/z 677.6236 为分子离子峰，与豆甾醇油酸酯分子质量相符，因此推断化合物2 为豆甾醇油酸酯，分子式为C47H80O2。Tan 等[21]以响应性、信噪比和线性度为选择标准研究植物甾醇酯的最佳特性离子，选择了m/z 394，m/z 255，m/z 43 作为豆甾醇油酸酯的特征离子。对化合物3 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 161.1331，m/z 175.1490，m/z 189.1631，m/z 203.1786，m/z 257.2258，m/z 261.2564，m/z 283.2622，m/z 315.3060，m/z 355.3364，m/z 397.3824，m/z 679.6389 等碎片离子峰 （图4c），其中m/z 397.3824 为β-谷甾醇特征峰，m/z 283.2622 为油酸（C18H34O2）特征峰，m/z 679.6389 为分子离子峰，参考相关文献[22]，与β-谷甾醇油酸酯分子质量相当，因此推断化合物3 为β-谷甾醇油酸酯（C47H82O2）。

表3 SE 一级质谱图表Table 3 SE first-order mass spectrometry chart

图4 SE 各峰二级质谱图Fig.4 Secondary mass spectrogram of each peak of SE

2.3.4 甾醇糖苷（SG）质谱解析 在SG 的最常见形式中，糖单体（通常是D-吡喃葡萄糖）连接到甾醇的C3 羟基上，SG 可水解生成甾醇[23]。SG 各峰具体信息见表4，为获得更多结构信息，需对其进行二级质谱裂解分析。对化合物1，裂解得到m/z 109.1009，m/z 135.1164，m/z 161.1324，m/z 175.1482，m/z 189.1645，m/z 203.1794，m/z 215.1804，m/z 243.2099，m/z 257.2264，m/z 273.2574，m/z 301.2880，m/z 383.3674，m/z 563.4326 等碎片离子峰（图5a），与相关文献[24-25]比对，甾醇糖苷的甾核母离子为菜油甾醇，m/z 563.4326 为分子离子峰，因此推断化合物1 为菜油甾醇葡萄糖苷（C34H58O6）。化合物2 的[M+HGlc]+离子峰m/z 397.3832 进行二级质谱裂解分析，得 到m/z 107.0854，m/z 147.1164，m/z 161.132，0，m/z 189.1630，m/z 203.1787，m/z 215.1794，m/z 243.2099，m/z 257.2259，m/z 261.2568，m/z 287.2730，m/z 315.3052，m/z 397.3832，m/z 577.4461 等碎片离子峰（图5b），结合相关文献[24，26]其裂解规律与β-谷甾醇相符合，甾醇糖苷的甾核母离子为β-谷甾醇，m/z 577.4461 为分子离子峰，因此推断化合物2 为β-谷甾醇葡萄糖苷（C35H60O6）。Munger 等[14]对以上3 种甾醇糖苷的研究表明，MS/MS 谱中主要的特征峰为m/z 147 和m/z 161，表示它们的△5 结构，谷甾醇糖苷和菜油甾醇糖苷侧链的缺失导致的特征峰为m/z 257，而豆甾醇糖苷的特征峰为m/z 255 表示C22 不饱和侧链。豆甾醇葡糖苷的进一步特征是m/z 297 的显性出现，这是区分不饱和侧链甾醇和饱和侧链甾醇的另一个特征。

表4 SG 一级质谱图表Table 4 SG first-order mass spectrometry chart

图5 SG 各峰二级质谱图Fig.5 Secondary mass spectrogram of each peak of SG

2.3.5 酰化甾醇糖苷（ASG）质谱解析 D-葡萄糖单体通过糖苷键与甾醇体中C3 的羟基结合，糖部分的C6 羟基进一步被脂肪酸酰化，从而形成ASG。ASG 各峰具体信息见表5，对化合物1 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 109.1010，m/z 135.1174，m/z 161.1331，m/z 175.1473，m/z 243.2115，m/z 257.2262，m/z 273.2581，m/z 301.2888，m/z 383.3673，m/z 799.6435 等碎片离子峰（图6a），m/z 383.3673 为[M+H-Glc-FA]+离子峰，甾核为菜油甾醇，m/z 799.6435 为分子离子峰[M+H]+，因此推断化合物1 为菜油甾醇葡萄糖苷棕榈油酸酯（C50H86O7）。Usuki 等[27]在对发芽糙米麸皮中酰化甾醇糖苷结构分析中，m/z 818.3 的MS/MS 谱图中，前体离子（m/z 818.3）为[棕榈酰化菜油酯 基 β-葡萄糖苷+NH4]+，m/z 401.2 和m/z 383.2 分别为[棕榈酰化β-葡萄糖-H2O+H]+和[菜油甾醇-H2O+H]+。对化合物2 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 109.1012，m/z 135.1167，m/z 161.1319，m/z 189.1643，m/z 203.1787，m/z 215.1792，m/z 273.2573，m/z 383.3670，m/z 855.7095等碎片离子峰 （图6b），m/z 383.3670 为[M+HGlc-FA]+离子峰，裂解规律同化合物1，甾核为菜油甾醇，m/z 855.7095 为分子离子峰[M+H]+，因此推断化合物2 为菜油甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯（C54H94O7）。对化合物3 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 107.0852，m/z 147.1166，m/z 161.1318，m/z 173.1323，m/z 187.1747，m/z 201.1640，m/z 257.2253，m/z 273.2578，m/z 395.3676，m/z 835.6471等碎片离子峰 （图6c），m/z 395.3676 为[M+HGlc-FA]+离子峰，甾核为豆甾醇，m/z 835.6471 为分子离子峰[M+H]+，因此推断化合物3 为豆甾醇葡萄糖苷亚麻酸酯（C53H86O7）。对化合物4 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 109.1016，m/z 135.1166，m/z 147.1169，m/z 189.1644，m/z 203.1784，m/z 257.2265，m/z 287.2744，m/z 315.3036，m/z 397.3837，m/z 869.7251 等碎片离子峰（图6d），m/z 397.3837 为[M+H-Glc-FA]+离子峰，其裂解规律与β-谷甾醇相符，甾核为β-谷甾醇，m/z 869.7251为分子离子峰[M+H]+，因此推断化合物4 为β-谷甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯（C55H96O7）。对化合物5 进行二级质谱裂解分析，得到m/z 109.1015，m/z 133.1007，m/z 147.1165，m/z 161.1323，m/z 203.1795，m/z 215.1785，m/z 355.3371，m/z 397.3829，m/z 837.6576 等碎片离子峰（图6e），m/z 397.3829 为

表5 ASG 一级质谱图表Table 5 ASG first-order mass spectrometry chart

图6 ASG 各峰二级质谱图Fig.6 Secondary mass spectrogram of each peak of ASG

[M+H-Glc-FA]+离子峰，甾核为β-谷甾醇，m/z 837.6576 为分子离子峰[M+H]+，因此推断化合物5为β-谷甾醇葡萄糖苷亚麻酸酯 （C53H88O7）。Yamauchi 等[28]采用LC-MS 法从红甜椒中检测出β-谷甾醇基（6'O-亚麻酸酰基）葡萄糖苷，得到如下质谱数据m/z 859（[M+Na]+），m/z 411（[C29H47O]+），m/z 397（[C29H49]+），m/z 215（[C16H23]+），m/z 261（[R]+），[R]+为脂酰部离子。其裂解规律与化合物5 基本符合，m/z 859（[M+Na]+-Na+H）即为m/z 837（[M+H]+）。

3 结论

本研究采用固相萃取法（SPE）分离花菜中4种结合状态的植物甾醇，再用UPLC-Triple-TOF/MS 法分析鉴定其甾醇的种类与结构。结果表明，通过紫外分光光度法粗测花菜中甾醇含量为（5.034±0.097）mg/g。固相萃取法分离纯化4 种结合状态的甾醇最佳洗脱条件为6 mL 己烷-乙醚（99∶1）洗脱SE，6 mL 己烷-乙醚（85∶15）洗脱FS，6 mL 庚烷-异丙醇（92∶8）洗脱ASG，7 mL 庚烷-异丙醇（85∶15）洗脱SG。在最佳洗脱条件下得到的甾醇的洗脱量分别为SE：（334.69±18.09）μg，FS：（695.64±31.50）μg，ASG：（1856.69±38.22）μg，SG：（828.66±32.78）μg。花菜中主要含有的游离甾醇（FS）有豆甾醇、菜油甾醇、羽扇豆醇、β-谷甾醇，含有的甾醇酯（SE）有菜油甾醇亚油酸酯、豆甾醇油酸酯、β-谷甾醇油酸酯，含有的甾醇糖苷（SG）有菜油甾醇葡萄糖苷、β-谷甾醇葡萄糖苷，含有的酰化甾醇糖苷（ASG）有菜油甾醇葡萄糖苷棕榈油酸酯、菜油甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯、豆甾醇葡萄糖苷亚麻酸酯、β-谷甾醇葡萄糖苷二十碳烯酸酯、β-谷甾醇葡萄糖苷亚麻酸酯。