藏药肺热普清散中乌头碱的限量检测

马 静，邹 丽△，王 曙

（1.四川省药品检验研究院院·四川省医疗器械检测中心，四川 成都 611731；2.四川大学华西药学院，四川 成都 610041）

肺热普清散（藏文名为洛才更赛），收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药：第一册》［1］中，主要由天竺黄、红花、力嘎都、丛菔、铁棒锤幼苗等14味藏药组方，具有清肺、泄热、消炎功效，可用于治疗小儿肺炎、流感、风热、疠热等。方中铁棒锤幼苗为铁棒锤Aconitum pendulumBusch和伏毛铁棒锤A.flavumHand.Mazz.的干燥幼苗，为藏医、羌医和回医民族习用药材，多用于治疗感冒、瘟疫、热毒、疮疔等［2-3］。铁棒锤有大毒，各器官中均含有二萜生物碱，含量由高到低依次为根、果、茎、叶，母根和子根毒性虽大，但疗效显著，幼苗的毒性稍小，但疗效稍次［4］。块根中的总生物碱含量随生长发育期的变化而不同，其中6～11月的块根中总生物碱含量随生长期的延长而逐渐升高，10 月的含量可达（9.07±0.92）mg/g［5-7］。肺热普清散方中所用铁棒锤幼苗而非块根，说明藏医药前辈已注意到了该类药材的毒性。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法对该制剂中含有双酯型二萜类生物碱中主要成分乌头碱进行含量限度检测，克服了薄层色谱鉴别中样品的杂质干扰和斑点不清晰的状况［8-12］。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-10AT型高效液相色谱仪，包括SPD-M10Avp型紫外检测器、CLASSVP 工作站（日本Shimadzu 公司）；HWS24 型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；XP205DR 型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药

肺热普清散（西藏神猴药业有限责任公司，批号分别为171101，171102，171103，171201，171202，171203）；乌头碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110720-200410，含量＞98.0%）；醋酸铵、乙腈、四氢呋喃为色谱纯，乙醇、盐酸、氨水、乙酸乙酯为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex ODS 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L醋酸铵（A，用氨水调pH至10）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液制备

对照品溶液：精密称取乌头碱对照品14.4 mg，置100 mL 容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液溶解并定容，摇匀，制成质量浓度为0.144 mg/mL 的对照品贮备液；精密吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液定容，摇匀，制得质量浓度为14.4 μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：取样品20 g，用乙醇200 mL 加热回流提取2 次，每次1 h，合并提取液，滤过，蒸干，残渣加2%盐酸溶液40 mL使溶解，用氨水调pH 至5；经D101大孔吸附树脂（柱体积为50 mL），依次用水和10%乙醇150 mL 洗脱，弃去洗脱液，再用85%乙醇100 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加2%盐酸溶液40 mL 溶解，并转移至分液漏斗中，用氨水调pH 至10，以乙酸乙酯萃取3 次，每次40 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

阴性对照品溶液：按处方工艺制备不含铁棒锤幼苗的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2 项下3 种溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，理论板数按乌头碱峰计应不低于2 000；分离度大于1.5，基线分离良好。色谱图见图1。

线性关系考察：取2.2 项下对照品溶液适量，加异丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液，制成质量浓度分别为4.6，8.8，24.0，48.0，72.0，144.0 μg/ mL 的系列对照品溶液。精密吸取10 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以乌头碱进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=49 878X+8 166（r=0.999 6，n=6）。结果表明，乌头碱进样量在0.046～1.440 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

定量限与检测限考察：分别精密量取2.2项下对照品溶液适量，倍比稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）10∶1 和3∶1 时的质量浓度记作定量限和检测限。结果乌头碱的定量限和检测限分别为5.0 μg/mL和1.2 μg/mL。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果乌头碱峰面积的RSD为1.08%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果乌头碱峰面积的RSD为1.43%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置10 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品（批号为171101）适量，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果乌头碱平均含量的RSD为1.51%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为171101）适量，共6份，分别加入一定质量浓度的对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取6 批样品各适量，分别按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定3 次，记录峰面积，并计算样品含量。结果见表3。

表3 样品中乌头碱含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of aconitine in the samples（mg/g，n=3）

健康成人口服0.2 mg 乌头碱可发生中毒反应，2.0～4.0 mg 即可致死。本试验中，乌头碱的平均含量为0.004 5 mg/g，肺热普清散的用量为每次1 袋，每袋1 g，每日2次，故每日服用乌头碱的量为9.0 μg，远低于乌头碱的中毒剂量，表明在该剂量下常规用药合理、安全。

3 讨论

肺热普清散为藏药，藏药的来源多为民间草药，由于人们对民族医药的认知过少，常忽略个别药材毒副作用的危害，加之我国民族药的有效性、安全性和毒性评价体系不健全，一直影响和制约着民族医药产业的发展。预试验中测定过铁棒锤幼苗中双酯型生物碱（乌头碱、次乌头碱、新乌头碱），但仅检出乌头碱，故本研究中仅对不同来源铁棒锤幼苗药材中的乌头碱进行了含量测定，并制订了肺热普清散中乌头碱的限量。

预试验中也考察了不同流动相，包括0.25 mol/ L乙酸铵溶液（用浓氨水调pH 至9.5）-乙腈（48∶52，V/V）［13］，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾-醋酸-异丙醇（67∶173∶4∶4，V/V/V/V）［14］，甲醇-0.2 mol/ L 醋酸铵-冰醋酸（67∶33∶1，V/V/V）［15］，以及乙腈-四氢呋喃（25∶15，V/V）-0.1 mol/L 醋酸铵（梯度洗脱）［16］对结果的影响，但部分主峰与其他杂质峰不能完全分离，或阴性干扰较严重。故对上述流动相条件进行了优化，以0.05 mol/L 乙酸铵溶液（pH 10）-乙腈为流动相进行梯度洗脱时的效果较好，杂质无干扰。

预试验中还考察了不同厂家的色谱柱，包括Shimpack C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm；日本Shimadzu 公司）和Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；广州菲罗门科学仪器有限公司），结果表明，在不同色谱柱上，基线分离均较好，含量测定结果无明显差异。

综上所述，所建立的方法稳定可靠，重复性好，可用于测定肺热普清散中乌头碱的含量。