不同配比乌头汤组方中两种生物碱含量变化

李玲，刘殿高，张译文，赵春杰

(沈阳药科大学药学院，110016)

乌头汤是东汉著名医家张仲景创制的名方，该方由制黄芪、麻黄、芍药、甘草(炙)、川乌组成，具有温经散寒、祛湿镇痛的功效，主治寒湿痹症［1］。方中以川乌温经祛湿、散寒镇痛，芍药缓急舒经镇痛，以利筋骨屈伸［2］。制川乌与麻黄相配，祛痹镇痛之力较著［3］。乌头虽是有毒之品，在临床上却广泛应用于风寒湿痹、关节疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛、麻醉镇痛等［2］。乌头中的有毒成分也是其有效成分。研究发现，甘草、白芍等对乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱影响较大［4］。而药物与剂量是影响方剂疗效的两大因素，药物组成相同的方剂，在剂量或配比不同时疗效迥异，日本学者渡边熙说:“汉药之秘，不可告人者，即在药量［5］。”因此，笔者在本实验中考察乌头汤中制川乌与其余各味药不同配比时对新乌头碱和次乌头碱含量的影响，以期调整和改善乌头汤的组成配比，在其毒性不超限量的前提下，使新乌头碱和次乌头碱的含量达到较大值，以加强治疗效果。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国 Agilent公司)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，BS110型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，TG332A型微量分析天平(上海分析天平厂)，AUTOSCIENCE AS3120超声仪(功率 120 W，频率40 kHz)。次乌头碱、新乌头碱标准品(均购于中国药品生物制品检定所，批号分别为0798-9403和0799-9403)。制川乌、麻黄、白芍、黄芪、炙甘草均购自沈阳四方药大药房，并经沈阳药科大学中药学院贾景明副教授鉴定，分别为Aconiti Radix Cocta，Ephedrae Herba，Paeoniae Radix Alba，Astragali Radix，Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praeparata Cum Melle。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温:30 ℃，流动相 A:乙腈-四氢呋喃(25∶15)，流动相 B:0.1 mol·L-1醋酸铵(每1 000 mL加冰醋酸 0.5 mL)，A-B(20∶80);流速:1.0 mL·min-1，检测波长:235 nm。

2.2 供试品溶液的制备 乌头汤中制川乌6 g为定值，其他各味药材(麻黄、白芍、黄芪、甘草)按照表1安排正交实验，采用L25(56)正交实验表，以新乌头碱和次乌头碱的含量之和作为考察指标。取组方中各药材，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液5 mL，精密加入乙酸乙酯-异丙醇(1∶1)溶液100 mL，称定质量，超声提取(功率120 W，频率40 kHz，水温＜25℃)30 min，放冷，再称定质量，用上述溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50 mL，减压回收溶剂至干(＜40℃)，残渣用异丙醇-三氯甲烷(1∶1)溶解并定容至5 mL量瓶中，用微孔滤膜(孔径0.45 μm)滤过，即得。

表1 正交实验因素水平表Tab．1 The factors and levels g

2.3 对照品溶液的制备 取新乌头碱、次乌头碱对照品适量，精密称定，分别加异丙醇-三氯甲烷(1∶1)溶解并制成0.396和0.974 mg·mL-1的对照品溶液。

2.4 色谱系统适用性实验 取供试品溶液、对照品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样5 μL分析，结果如图1所示，各色谱峰与相邻色谱峰的分离度均＞1.5。拖尾因子均在0.95～1.05之间。新乌头碱、次乌头碱的仪器精密度RSD分别为1.1%和1.9%。

2.5 标准曲线的绘制 分别精密量取新乌头碱、次乌头碱对照品溶液适量，置5 mL量瓶中，用异丙醇-三氯甲烷(1∶1)稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件下进样5 μL，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果新乌头碱、次乌头碱回归方程分别为Y=4.253X+30.98(r=0.999 4)，Y=3.713X+96.02(r=0.999 3)，线性范围分别为4.95 ～79.20，12.18 ～194.80 μg·L-1。

2.6 乌头汤中各组分对新乌头碱和次乌头碱的影响 按表2下的各组分正交实验组方制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下进样5 μL，将测得的新乌头碱、次乌头碱峰面积分别代入“2.5”项下标准曲线中，计算各配比组方中新乌头碱、次乌头碱的含量，结果见表2。

图1 2种溶液的典型色谱图A.样品溶液;B.混合对照品溶液 (新乌头碱396 μg·mL-1，次乌头碱 974 μg·mL-1);1.新乌头碱;2.次乌头碱Fig．1 Representative chromatogram of the two kinds of solutionsA.sample;B.mixed reference substance(mesaconiatine 396 μg·mL-1，hypaconitine 974 μg· mL-1);1.mesaconiatine 2.hypaconitine

由表2可见，各因素对新乌头碱和次乌头碱含量之和的影响为D＞C＞A＞B，最佳水平组合为A5B1C2D5，即黄芪、炙甘草各13 g，麻黄5 g，白芍7 g。

综合分析，乌头汤中制川乌与其余各味药的不同配比对新乌头碱和次乌头碱含量影响很大，其中炙甘草的量影响最大，白芍次之。当制川乌、麻黄、黄芪、白芍和炙甘草组方为 6，5，13，7，13 g时，新乌头碱和次乌头碱含量之和最大。

2.7 制川乌的双酯型生物碱检查 根据《中华人民共和国药典》2010年版的规定，制川乌含双酯型生物碱以乌头碱、次乌头碱及新乌头碱的总量计，不得超过0.040%。本实验中因制川乌所含乌头碱的量很少或几乎没有而未被检测到，所以制川乌中双酯型生物碱的量以新乌头碱和次乌头碱的总量计，其含量值最大为0.003 5%，远小于规定值，因此符合规定。

3 讨论

笔者在本实验中以制川乌的量为定值，在原方的基础上，设计乌头汤中其余各味药进行正交实验得到不同的组成，与制川乌进行配比，考察各味药的用量对制川乌中有效成分的影响，以期改善原方的用量配比，达到最佳的治疗效果。本实验以流动相A∶ 乙腈-四氢呋喃(25∶15)，流动相 B:0.1 mol·L-1醋酸铵(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)为流动相，A-B(20∶80)梯度洗脱，比《中华人民共和国药典》2010年版梯度洗脱的方法有所改进，能够简化实验程序，且基线稳定，漂移程度小［6］。

表2 新乌头碱，次乌头碱含量之和正交实验结果Tab．2 The results of orthogonal test on the content sum of mesaconiatine and hypaconitine

本实验旨在考察乌头汤的组方配比对制川乌中双酯型生物碱的影响，因此采用《中华人民共和国药典》2010年版方法以乙酸乙酯-异丙醇(1∶1)溶液超声提取，而不是采用传统的水煎煮提取，目的是提高提取效率和新乌头碱及次乌头碱的含量，有利于测定。

本实验仅从乌头汤所含的新乌头碱和次乌头碱的量的总和在不超过限量的前提下达到较大值方面进行考察，下一步将会进行药效实验，将新组方与原方对比，考察新组方的实际疗效。

［1］ 刘伟栋，施旭光，旷永强，等.乌头汤对RA大鼠相关细胞因子影响的研究［J］.中药材，2009，32(8):1267-1269.

［2］ 余成浩.乌头类有毒中药常用配伍药对的物质基础研究［D］.成都:成都中医药大学，2006.

［3］ 刘娜，刘文.HPLC法测定乌头汤水煎液中盐酸麻黄碱的含量［J］.中国民族民间医药，2008，20(7):33-35.

［4］ 刘忠英.中药化学成分在炮制、配伍和提取过程中的化学变化及其转运机制的研究［D］.长春:吉林大学，2005.

［5］ 施旭光，王沛坚.非线性回归分析不同剂量配伍对乌头汤中主要化学成分的影响［J］.中药新药与临床药理，2009，20(1):55-58.

［6］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:37.