Hsa_circ_0005019在结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移中的作用及其预后预测价值

孙振强，党 钦，邵 博，赵陆洋，陈 壮，张 浩，袁维堂

1)郑州大学第一附属医院结直肠肛门外科 郑州 450052 2)郑州大学医学科学院 郑州 450052 3)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

结直肠癌是全球第4位致死性癌症，每年有近90万患者死亡，患者确诊时往往已处于晚期[1-2]。由于术后复发或转移，结直肠癌患者的5 a生存率较低[3]。目前结直肠癌治疗方法包括手术、术后辅助化疗、放疗、免疫治疗和生物靶向治疗等[2]，但由于治疗效果不佳，患者生活质量及预后均不理想[4]。因此，积极寻找结直肠癌转移标志物，对提高其早期诊断率和改善预后具有重要意义。

最近，环状RNA成为癌症研究的热点，涉及肿瘤细胞增殖[5]、转移[6]、血管生成[7]、肿瘤干细胞干性[8]和耐药性[9]等。研究[10]表明，亲本基因的表达与相应的环状RNA的表达处于动态平衡中，两者作用相反。在肿瘤的发展中，Zbtb7a基因的环状RNA与其线性mRNA有相反的作用[11]。通过circBase数据库，我们发现环状RNA hsa_circ_0005019在结直肠癌中低表达，而其亲本基因CHSY1能够促进胶质母细胞瘤[12]、肾透明细胞癌[13]及结直肠癌[14]的进展。本研究探索了hsa_circ_0005019在结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移中的作用及对患者预后评估的价值，以期发现新的生物学标志物用于结直肠癌治疗靶点的选取和预后评估。

1 材料与方法

1.1 材料人结肠癌细胞系HCT116购自中国科学院上海细胞生物学研究所。66对结直肠癌原发灶组织(多位点取样)和匹配的距原发灶3 cm以上的癌旁正常肠黏膜组织均取自郑州大学第一附属医院2016年11月至2020年12月的手术切除标本。病例入选标准：无术前化疗、放疗或靶向治疗；不合并其他类型肿瘤；无自身免疫性疾病。66例中男36例，女30例，年龄22～82岁，其中≥60岁者34例。病理学分级：Ⅰ、Ⅱ级42例，Ⅲ、Ⅳ级24例；TNM 分期[基于NCCN(2019)指南]：Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期25例；肿瘤类型：非黏液腺癌48例，黏液腺癌18例；浸润深度：浸润至肌层18例，浆膜层48例。术中获得的标本立即液氮速冻，-80 ℃保存。患者均签署知情同意书，本方案经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，编号为2019-KY-423。

1.2 HCT116细胞培养及分组HCT116细胞用含体积分数10%胎牛血清(Gibco公司)的高糖DMEM培养基(Sigma公司)，在37 ℃、体积分数5% CO2条件下孵育。hsa_circ_0005019特异性小干扰RNA(siRNA)及对照siRNA由锐博生物公司(中国广州)设计并合成。6孔板内每孔约接种3×105个HCT116细胞,24 h细胞贴壁后分为2组，用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher公司)分别转染hsa_circ_0005019 siRNA(siRNA组)和对照siRNA(阴性对照组)，继续培养48 h。采用RNAiso Plus试剂(TaKaRa公司)提取细胞中总RNA，评价RNA质量和完整性后使用cDNA反转录试剂盒(TaKaRa公司)将1 μg RNA反转录为cDNA。使用基因组DNA(gDNA)提取试剂盒(TIANGEN公司)提取细胞中的gDNA。hsa_circ_0005019上游引物序列5’-GCACGACCACTACTTGGACA-3’，下游引物序列5’-CACCATTCTCCGAAGCACCT-3’；GAPDH上游引物序列5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；hsa_circ_0005019反向引物上游引物序列5’-GAAG GTGTGTCCGGAGGTTT-3’，下游引物序列5’-TGTC CAAGTAGTGGTCGTGC-3’。使用预混荧光染料(翌圣公司)进行扩增，反应体系(20 μL)：荧光染料10 μL，无酶水(TaKaRa公司) 6 μL，模板cDNA或gDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，40个循环；60 ℃退火30 s；最后60 ℃ 1 min，95℃ 1 s。采用2-ΔΔCt法计算hsa_circ_0005019的相对表达量。实验重复3次。制备30 g/L的琼脂糖凝胶，电泳产物于凝胶成像仪(Tanon公司)中曝光，观察正、反向引物在cDNA和gDNA中的扩增情况。

1.3 沉默hsa_circ_0005019对HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响使用CCK-8试剂盒(Dojindo公司)评价细胞增殖能力。取HCT116细胞接种于96孔板，每孔约接种1.5×103个细胞，按1.2中分组分别转染hsa_circ_0005019 siRNA和对照siRNA，每组5个复孔。收集培养12、24、48和72 h的细胞，向培养基中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃下孵育2 h，测定450 nm处的吸光度(参比波长为570 nm)，用于评价细胞增殖能力。实验重复3次。

使用Transwell小室(膜孔径8 μm，Corning公司)评估HCT116细胞的迁移和侵袭能力。取HCT116细胞，按1.2中分组分别转染hsa_circ_0005019 siRNA和对照siRNA。继续培养48 h，收集、消化HCT116细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为3×106个/mL，将100 μL细胞悬液加入上室，预先将含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(600 μL)加入下室。在不含有基质胶的情况下进行迁移试验，并使用DMEM培养基稀释5倍后的基质胶(Corning公司)(100 μL/孔于小室中孵育1 h)进行侵袭实验。在37 ℃、体积分数5%CO2的恒温培养箱中孵育72 h后，吸去上室和下室残留培养基，加入600 μL 40 g/L 的多聚甲醛固定至少30 min，1 g/L 的草酸铵结晶紫染色液(Solarbio公司)染色30 min。用PBS洗涤3次后，用无菌棉签轻轻擦拭小室孔膜，晾干。用型号为Olympus FV1000的共聚焦显微镜观察并计数迁移细胞数和侵袭细胞数。实验重复3次。

1.4 结直肠癌和配对癌旁正常组织中hsa_circ_0005019表达水平的检测采用Trizol试剂提取结直肠癌组织和配对癌旁正常肠黏膜组织中总RNA，反转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行荧光定量PCR，测定组织中hsa_circ_0005019的表达，每个样本重复3次。方法步骤同1.3。

1.5 hsa_circ_0005019表达对结直肠癌预后的影响选择结直肠癌组织中hsa_circ_0005019表达水平的均值作为截断值，将66例患者分为低表达组(<均值)和高表达组(≥均值)，绘制2组患者的K-M生存曲线。总生存期(OS)定义为从腹腔镜下结直肠癌根治术后开始至死亡或随访结束时间。根据中国临床肿瘤学会《结直肠癌诊疗指南(2020版)》中的随访表Ⅰ级推荐规范进行门诊复查或电话随访等。随访截止日期是2020年12月31日。

1.6 统计学处理使用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8.0软件处理数据。采用两独立样本t检验比较siRNA组和阴性对照组HCT116细胞中hsa_circ_0005019表达水平，增殖、迁移、侵袭细胞数等指标的差异，采用配对t检验比较结直肠癌和配对癌旁正常肠黏膜组织中hsa_circ_0005019表达水平的差异。将性别、年龄、病理学分级、TNM分期、肿瘤类型、浸润深度作为调整变量，hsa_circ_0005019表达(0=低表达，1=高表达)作为自变量纳入Cox回归模型，分析hsa_circ_0005019表达对结直肠癌患者预后(0=生存，1=死亡)的影响。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 阴性对照组和siRNA组细胞hsa_circ_0005019表达水平的比较siRNA组hsa_circ_0005019的相对表达量为(0.528±0.021)，低于阴性对照组(1.000±0.034)(t=23.190，P<0.001)。

2.2 阴性对照组和siRNA组细胞增殖、侵袭和迁移能力的比较细胞生长曲线见图1。转染12、24、48和72 h后，siRNA组细胞的增殖能力强于阴性对照组，侵袭细胞数和迁移细胞数多于阴性对照组。见表1。

图1 2组细胞的生长曲线

表1 阴性对照组和siRNA组侵袭细胞数和迁移细胞数比较

2.3 结直肠癌和配对癌旁正常肠黏膜组织中hsa_circ_0005019表达水平的比较结直肠癌组织中hsa_circ_0005019的相对表达量为(0.759±0.063)，低于癌旁正常组织(1.000±0.082)(t配对=7.504，P<0.001)。此外，我们发现利用hsa_circ_0005019的反向引物在HCT116细胞的cDNA中扩增出了目的基因片段，而未观察到该反向引物在gDNA中成功扩增出相应片段(图2)。

图2 hsa_circ_0005019正、反向引物的扩增结果

2.4 hsa_circ_0005019的表达对结直肠癌患者预后的影响66例患者中失访12例(高表达组4例，低表达组8例)。生存分析结果(图3)显示，高、低表达组生存曲线差异有统计学意义(χ2=4.296，P=0.038)，高表达组预后更好。Cox回归分析结果显示，hsa_circ_0005019表达水平是结直肠癌预后的预测因素(HR=0.104，95%CI：0.013～0.854，P=0.035)。

图3 高、低表达组生存曲线的比较

3 讨论

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，症状多样且发病年龄趋于年轻化[15]。结直肠癌患者就诊时常伴有远处转移，预后较差[16]，因此，迫切需要探索新的靶向治疗药物。

越来越多的研究[17-19]指出，环状RNA分子在结直肠癌中表现出至关重要的作用。据报道[17]，环状RNA CIRS-7是影响结直肠癌患者总生存期和癌细胞转移的独立危险因素。也有报道[18]环状RNA GLIS2可激活结直肠癌细胞中的NF-κB通路，诱导产生促炎趋化因子，通过募集白细胞触发肿瘤相关炎症。环状RNA 001971可通过发挥竞争性内源性RNA的作用，解除miR-29c-3p对血管内皮生长因子的抑制作用，从而加速结直肠癌细胞的增殖、侵袭和血管生成[7]。环状RNA ITGA7通过抑制Ras信号通路和促进ITGA7的转录，抑制结直肠癌细胞的增殖和转移能力[19]。Li等[20]的研究表明血液中hsa_circ_0001900、hsa_circ_0001178和hsa_circ_0005927含量的联合应用比癌胚抗原能更可靠地区分结直肠癌和非结直肠癌患者。

我们前期利用生物信息学方法在circBase数据库发现了一种新的环状RNA hsa_circ_0005019，其生物学功能目前尚未见报道。本研究结果显示， hsa_circ_0005019在结直肠癌细胞中作为抑癌基因发挥作用，敲低其表达结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强。此外，与癌旁正常肠黏膜组织比较，结直肠癌组织中hsa_circ_0005019呈低表达；生存分析结果显示hsa_circ_0005019高表达的结直肠癌患者预后更好；Cox回归分析结果显示，hsa_circ_0005019表达水平是结直肠癌预后的预测因素。以上结果均表明hsa_circ_0005019是一种新的抑癌因子，有望成为新的结直肠癌预后预测指标。

综上所述，环状RNA hsa_circ_0005019在结直肠癌的增生及转移中扮演着抑癌角色，高表达者预后更好。hsa_circ_0005019在结直肠癌中的抑癌作用为研究肿瘤发生发展机制提供了新的线索，hsa_circ_0005019有望成为结直肠癌的治疗靶点和用于预后评估。