盲肌样蛋白1（MBNL1）对血小板衍生生长因子诱导大鼠血管平滑肌细胞表型转换的作用研究

安 洁，信栓力，刘吉祥，常 超，赵秀峰，郑 杰，连晶晶

（邯郸市第一医院心内一科1，神外一科2，河北 邯郸 056002）

血管壁由外膜、中膜及内膜构成，其中血管平滑肌细胞（VSMCs）占据的比例最高。在正常血管中，VSMCs 主要发挥收缩舒张功能，表现为收缩表型，在细胞发育过程及某些病理状态下，细胞受到各种生化因子、机械刺激、细胞外基质组分改变等因素的影响，伴随着α-SMA、SM-MHC 等收缩基因表达下调、细胞过度增殖、细胞迁移、细胞外基质分泌增多等一系列细胞特性改变[1]，VSMCs 发生细胞表型转换由收缩型向合成型转化[2]。VSMCs 表型转换既是对刺激的一种适应性反应，也参与了多种心血管疾病的发病过程，但其具体机制目前尚不完全明确，有待进一步阐明。MBNL1 属于盲肌样蛋白家族，是一种重要的RNA 结合蛋白，主要功能是调控多种前体mRNA 的选择性剪接[3]、调控mRNA 运输及定位[4]。选择性剪接是一种转录后调控机制，经选择性剪接可以产生同一基因的不同蛋白异构体，进而发挥不同生物作用。MBNL1 的缺失是强直性肌营养不良的发病机制之一[5，6]，提示MBNL1 对于肌源性细胞的发育分化起着至关重要的作用。既往研究表明MBNL1 可以调控骨骼肌及心肌的分化发育及病理过程的发生[5-8]。然而关于MBNL1 在血管平滑肌中的研究较少。因此，本研究旨在观察MBNL1 在VSMCs 表型转换中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 雄性SD 大鼠，体重150～200 g，由华中科技大学实验动物中心提供，实验动物饲养于SPF 级动物房，提供12 h 光照，食水充足，所有实验均符合实验动物管理规定；DMEM 培养基、青霉素-链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA 购于吉诺生物公司；胎牛血清购于Bioind 公司；BCA 试剂盒、PVDF 膜、Alexa Fluor594标记抗小鼠IgG抗体、Lipofectamine 2000 购于赛默飞世尔科技公司；Ⅱ型胶原酶、弹力蛋白酶购于Worthington 公司；大鼠PDGF-bb 购于金斯瑞生物公司；抗-MBNL1 抗体、抗-a-sma 抗体、抗-a-tubulin 抗体、HRP 偶联抗兔IgG 抗体、HRP 偶联抗鼠IgG 抗体购于三鹰生物公司；siRNA 购于锐博生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠血管平滑肌原代细胞的分离及培养 选取150～200 g 雄性SD 大鼠，腹腔麻醉处死，酒精消毒后置于无菌实验台内，开胸分离胸主动脉，剥离结缔组织，用PBS 清洗血污后，放入浓度3 mg/ml 的Ⅱ型胶原酶中，37 ℃酶消10～15 min。剥去血管外膜，将血管剪为2 mm2大小组织块，加入3 mg/ml 的Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化0.5 h。再加入等体积浓度1 mg/ml的弹力蛋白酶,37 ℃消化1.5 h 左右，加入血清终止消化，小心吹散组织块，离心后即可获得原代细胞。将细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基重悬，接种于培养皿，置于37 ℃5%CO2培养基箱中，每2～3 d 换液，细胞汇和度达90%进行传代。选用第3～8 代细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞鉴定 将大鼠VSMCs 接种于96 孔板，待细胞密度达30%～40%进行免疫荧光实验对细胞进行鉴定。弃去培养基，用PBS 清洗后加入4%多聚甲醛，室温下固定细胞15 min，随后PBS 清洗3 次。加入0.5%Triton-X-100 室温下通透10 min，用PBST 清洗3次。加入1% BSA 室温下封闭0.5 h。加入一抗（稀释浓度为1∶200），4 ℃放置约12 h，PBST 清洗3 次。加入二抗（稀释浓度为1∶500），室温下避光放置1～2 h，PBST 清洗3 次。加入DAPI 溶液染核，室温下避光放置10 min，PBST 清洗3 次，观察并拍照。

1.2.3 PDGF-bb 刺激实验及分组 将大鼠VSMCs 接种于培养皿，待细胞汇合度达70%，弃去完全培养基，加入不含血清的DMEM 培养基饥饿24 h，再次更换无血清的培养基，对照组加入PBS，其他各组加入PDGF-bb，终浓度分别为10、20、40、80 ng/ml，48 h 后提取总蛋白。

1.2.4 siRNA 转染 将大鼠VSMCs 接种于12 孔板，待细胞汇合度达80%～90%，更换为无血清培养基，使用Lipofectamine 2000 按照说明书分别转染siRNA-nc 及siRNA-mbnl1，siRNA-mbnl1 序 列如下:siRNA -1 GCTGCTGCACAGAAGTTAA,siRNA -2 GGTCGTTGCTCCAGAGAAA,siRNA-2 GCACAATGATTGATACCAA。6 h 后弃去培养液，更换为含10%血清培养基，24 h 后获取细胞用于迁移实验，48 h 后提取总蛋白进行检测。

1.2.5 细胞慢病毒感染 将大鼠VSMCs 接种于12 孔板，待细胞汇合度60%～70%，更换培养基并加入慢病毒，24 h 后换液，48 h 后获取细胞用于迁移实验，72 h 后提取总蛋白进行检测。

1.2.6 蛋白免疫印迹 使用RIPA 裂解液提取蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，取蛋白30 μg，加入5×loadingbuffer 配置为20 μl 体系，99 ℃变性10 min。将SDS-PAGE 凝胶放入电泳液中，加入marker 及蛋白样本于凝胶孔中，起初以80 V 恒压电泳，当蛋白到达分离胶，调整电压至100 V 继续电泳至底。将凝胶切下转移至转膜槽中，加入转膜液，置于冰水混合物中，以300 mA 恒流将蛋白转移至PVDF 膜。5%牛奶封闭液室温下封闭2 h，PBST 洗膜后，加入一抗（按1∶1000 稀释），4 ℃孵育过夜；PBST 洗膜3 次，加入二抗（按1∶2000 稀释），室温下孵育2 h。PBST 洗膜3 次，用ECL 发光液浇膜进行显影。

1.2.7 Transwell 细胞迁移实验以基质胶包被基底膜下室侧，并制备Lv-nc 组、Lv-mbnl1 组、siRNA-nc 组、siRNA-mbnl1 组细胞悬液。对照组下室中为完全培养基，刺激组下室中为含PDGF-bb 完全培养基，浓度为20 ng/ml。在上室中加入细胞液，每孔含细胞数为5×104个，培养12 h。取出Transwell 小室，用PBS充分浸泡基底膜，并置于结晶紫溶液中染色15 min，用PBS 浸泡3 遍，用棉签擦掉基底膜上侧细胞，进行观察并拍照。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0 进行统计分析，计数资料以（）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血管平滑肌原代细胞鉴定 对大鼠血管平滑肌原代细胞进行观察，细胞形态呈现为纺锤状，并呈典型峰谷样生长。对α-SMA 进行免疫荧光染色见图1，经鉴定细胞纯度在98%以上。

图1 大鼠血管平滑肌原代细胞免疫荧光鉴定

2.2 PDGF-bb 刺激大鼠VSMCs 后MBNL1 表达 给予VSMCs 不同浓度的PDGF-bb，α-SMA 蛋白表达下调呈现浓度依赖性，提示细胞模型造模成功；10、20、40、80 ng/ml 浓度刺激下MBNL1 蛋白表达量分别为（1.35±0.09）、（1.67±0.19）、（1.64±0.12）、（1.54±0.33），与对照组比较均增多，差异有统计学意义（P＜0.05），其中以20 ng/ml 最为显著，见图2。

图2 Western blot 检测不同浓度PDGF-bb 刺激下MBNL1 表达量变化

2.3 MBNL1 敲低及过表达效率检测 采用慢病毒过表达MBNL1，结果提示Lv-mbnl1 组较Lv-nc 组蛋白表达量显著增加，见图3A。分别以siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 转染细胞，siRNA-2 敲低效果最为明显，见图3B，后续实验选用siRNA-2 进行。

图3 Western blot 检测过表达及敲低效率

2.4 MBNL1 抑制大鼠VSMCs 迁移 分别在细胞水平过表达、敲低MBNL1，24 h 后进行Tranwell 迁移实验，结果显示Lv-mbnl1 组细胞迁移数为（0.86±0.07），少于Lv-nc 组（1），但差异无统计学意义（P＞0.05），Lv-mbnl1+PDGF-bb 组细胞迁移数为（3.36±0.25），少与Lv-nc+PDGF-bb 组的（4.21±0.27），差异有统计学意义（P＜0.05），见图4A、4C；siRNAmbnl1 组细胞迁移数为（1.82±0.12），较siRNA-nc组（1）增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；siRNAmbnl1+PDGF-bb 组细胞迁移数为（3.30±0.38），较siRNA-nc+PDGF-bb 组的（2.35±0.14）增多，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4B、4D。

图4 MBNL1 抑制大鼠VSMCs 迁移

3 讨论

我国心血管疾病死亡率高居首位,探究心血管疾病的发病机制是疾病的预防及治疗的重要内容。血管平滑肌表型转换过程中转录调节蛋白[9]、细胞周期蛋白[10]、收缩蛋白[11]、离子通道[12]等均存在选择性剪接调控，通过产生不同的蛋白异构体使细胞表型发生改变。MBNL1 作为一种广泛存在于各种细胞中的RNA 结合蛋白，近期被证实，参与转化生长因子（TGF-β）诱导的成纤维细胞分化，这一作用通过影响血清反应因子（SRF）前体mRNA 的选择性剪接实现[13]。另一项研究表明[8]，MBNL1 参与异丙肾上腺素诱导的心肌肥大过程，其机制为MBNL1 调控Myocardin 选择性剪接。SRF 是VSMCs 维持收缩表型的至关重要的转录因子，通过识别基因中的特定序列，启动下游标记性基因转录。SRF 广泛存在于多种细胞中，但其调控的收缩基因仅在平滑肌中高表达，这与转录共激活因子Myocardin 密切相关[14，15]。MBNL1 可以调控SRF 及Myocardin 选择性剪接，由此推测MBNL1 可能是血管平滑肌表型转换过程中发挥作用的重要分子。

本研究表明在细胞水平诱导表型转换模型，在各个浓度下MBNL1 表达水平上升，说明MBNL1 与VSMCs 表型转化相关。Woo CC 等[16]研究证实在人VSMCs 中，MBNL1 上调Myh11 等收缩基因表达，进而影响细胞表型转化。Li Y 等[17]研究表明在脂质、炎症因子等刺激下，MBNL1 表达下调引起VSMCs 巨噬细胞化，促进动脉粥样硬化的发生。但是MBNL1对于VSMCs 迁移能力的影响尚无报道。Chen J 等[18]研究证明MBNL1 可以抑制鳞状上皮癌细胞迁移，推测在平滑肌中可能有相似作用。为了进一步探究其对VSMCs 迁移能力的影响，在细胞水平对MBNL1 进行了过表达和敲低，随后检测了细胞的迁移能力。本研究结果发现，过表达MBNL1 可以抑制细胞迁移，但这种抑制作用在正常细胞中并不明显，仅在PDGF-bb 诱导的细胞表型转化中作用较为明显，这提示MBNL1 表达上升是对刺激的一种反馈性保护作用。而敲低MBNL1，不论有无PDGF-bb 作用，均能增强细胞迁移能力，说明MBNL1 对VSMCs收缩表型的维持不可或缺。综合以上结果，得出MBNL1 抑制VSMCs 发生细胞迁移，进而对血管平滑肌表型转换起到抑制作用。在PDGF-bb 诱导下MBNL1 表达上调是一种反馈性保护机制。

关于MBNL1 减弱VSMCs 迁移能力的具体机制还尚不明确，有期待进一步探究。伴随着VSMCs骨架蛋白及细胞外基质的改变，细胞迁移能力随之改变。骨架蛋白及外基质改变过程涉及到一些关键蛋白，如胶原蛋白I（Collagen I）[19]，基质金属蛋白酶（MMPs）[20]等。MBNL1 可能通过调控这些重要蛋白的选择性剪接，对VSMCs 迁移能力产生影响，将在下一步实验中加以验证。

综上所述，MBNL1 抑制VSMCs 迁移，进而影响血管平滑肌表型转换，这可能会成为多种心血管疾病防治的新靶点。