紫草素通过促进巨噬细胞Ⅰ型干扰素的产生抑制病毒感染

胡莉蔓 陈旭央 阮旦青 （乐清市人民医院儿科，温州 325600）

2019 年12 月发现的新型冠状病毒（SARSCoV-2）是一种新型单链RNA（ssRNA）病毒，它能引起严重的呼吸系统疾病（COVID-19），且导致了全球大流行，对全人类的健康构成了严重威胁［1］。在病毒感染发生时，天然免疫是抵抗病毒感染的第一道防线。天然免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原体相关的分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），如病毒核酸RNA和DNA，来响应病毒感染，快速启动免疫应答反应［2］。病毒RNA 主要由TLRs 成员（TLR3、7、8）和RLRs 成员（RIG-1、MDA5）等受体识别［3］；病毒DNA 主要由STING等受体识别。病毒核酸成分被模式识别受体识别后，募集下游接头蛋白包括TRIF、MAVS 和STING，随后激活下游激酶TBK1，从而激活NF-κB和转录因子IRF-3/7 并诱导Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子的产生。Ⅰ型干扰素能够诱导大量干扰素诱导基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的表达。干扰素诱导基因不仅可以抑制病毒从入侵到释放的多个阶段，还可以反馈调节干扰素的表达，从而最终控制病毒感染［4-5］。但是，诸如H1N1、HSV 等病毒同样可以通过抑制Ⅰ型干扰素的产生来逃脱宿主的杀伤［6］。因此，促进天然免疫应答是抵抗包括冠状病毒SARS-CoV-2在内的病毒感染的有效策略。

紫草素是从传统中药紫草中提取的萘醌类化合物［7］。研究发现紫草素能够抑制炎症反应、抗细胞凋亡、抗氧化和促进血管生成，从而能够改善糖尿病患者早期视网膜病变等症状［8-9］。此外，紫草素在肿瘤的发生发展中具有重要作用，通过阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡、抑制癌细胞转移和侵袭、诱导自噬和坏死等方式，紫草素可以有效抑制乳腺癌、宫颈癌等肿瘤的发生发展［10-14］。但是，紫草素在病毒感染中的作用尚不清楚。本课题以小鼠和巨噬细胞为研究对象，旨在探讨紫草素对小鼠和巨噬细胞抵抗水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）感染的影响及其机制，并为抵抗SARS-CoV-2提供有效策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠 C57BL/6 J小鼠（6～8周龄）购自SIPPRBK 实验动物有限公司。将所有小鼠饲养在浙江大学实验室动物中心（没有特定病原体的环境），所有动物实验均按照动物伦理委员会批准的规程进行（批号：ZJU-BEFS-2019015），并符合机构指导原则。

1.1.2 原代巨噬细胞 骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophages，BMDM）由小鼠骨髓诱导产生。从小鼠的股骨和胫骨收集骨髓细胞，将 20 ng/ml 重组小鼠 M-CSF（R&D 公司，416-ML）添加到含有10%FCS 的RPMI1640 培养基中，诱导BMDM。

1.1.3 试剂 紫草素（MCE公司，HY-N0822）；IFN-β ELISA 试剂盒（Invivogen 公司，luex-mifnbv2）；IL-6 ELISA 试剂盒（Invitrogen 公司，88-7064-88）；RNAiso plus（TaKaRa 公司，9109）；逆转录试剂盒（Toyobo 公司，FSQ-201）；SYBR Green master Rox（Roche 公司，04707516001）；细胞裂解缓冲液（Cell Signling Technology 公司，9803）和蛋白酶抑制剂（Sigma 公司，P8340）；BCA 试剂盒（Pierce 公司，23235）；Pierce 化学发光 ECL 试剂盒（Thermo 公司，32209）；RNAiso plus 试剂（TaKaRa 公司）；逆转录酶（Toyobo 公司）；SYBR Green master Rox（Roche公司）；聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad 公司）；TBK1 抗体（3504）、p-TBK1 抗体（5483）、IRF3抗体（4962）、p-IRF3抗体（4947）、p-JNK抗体（9251）、JNK 抗体（9252）、p-p65 抗体（3033）、p65 抗体（8242）、p-p38 抗体（9215）和 p38 抗体（9212）均购自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染 用 VSV（MOI=0.1 或 1）或者VSV-GFP（MOI=1）感染骨髓来源的巨噬细胞进行细胞实验。通过腹腔内注射VSV（剂量1×108PFU/g）感染小鼠进行体内研究。

1.2.2 VSV TCID50 测定 分别获取感染VSV 小鼠的脾脏、肝脏和肺脏组织上清以及感染VSV 的巨噬细胞上清液，利用倍比稀释方法稀释上清液，加入到Vero 细胞上进行感染。然后用含有0.6%低熔点琼脂糖的生长培养基覆盖细胞。16 h 后，利用0.5%结晶紫进行染色，并计数形成的噬菌斑。

1.2.3 细胞分析 原代巨噬细胞在GFP-VSV 感染16 h 后，用胰蛋白酶消化细胞并用PBS 洗涤。重悬于100 μl PBS中，通过流式细胞仪（FACS）分析细胞。

1.2.4 ELISA 收集细胞上清液或外周血，使用ELISA试剂盒检测IFN-β或IL-6细胞因子的浓度。

1.2.5 荧光定量PCR 根据试剂说明，使用RNAiso plus试剂从细胞中提取总RNA。用逆转录酶逆转录形成单链cDNA。SYBR Green master Rox 用于定量实时逆转录酶-PCR 分析。qPCR 引物如下：VSV-G mRNA：正向5′-ACGGCGTACTTCCAGATGG-3′，反向5′-CTCGGTTCAAGATCCAGGT-3′；TNF-α mRNA：正向5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′，反向5'-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3'；IFN-β mRNA：正 向 5'-GGGAGAACTGAAAGTGGGAAA-3'，反 向5'-ACCTGCAAGATGTGGCAAAG-3'；β-actin mRNA：正向5'-GATGACGATATCGCTGCGCTG-3'，反向5'-GTACGACCAGAGGCATACAGG-3'。

1.2.6 Western blot 细胞用裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂处理后，离心并收取裂解上清，用BCA 试剂盒测定上清中蛋白浓度。蛋白质在变性处理后，将其等质量的加入到十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行凝胶电泳和转膜将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并在封闭液处理后，分别用以下的抗体和相应的二抗孵育。聚偏二氟乙烯膜上蛋白通过Pierce 化学发光ECL 试剂处理后，通过BIORAD Gel Doc XR 凝胶成像仪拍照获取蛋白条带。抗体的稀释比例如下：TBK1（D1B4；3504，1∶1 000）、IRF3（4962，1∶1 000）、p-IRF3（4D4G；4947，1∶5 000）、p-JNK（9251，1∶3 000）、JNK（9252，1∶1 000）、p-p65（3033，1∶3 000）、p65（8242，1∶1 000）、p-p38（9215，1∶3 000）和p38（9212，1∶1 000）。

1.3 统计学分析 本研究中的实验至少独立重复3 次。数据用表示，实验各组数据之间的统计学比较采用Student'st-test，小鼠存活期实验采用Kaplan-Meier 统计学方法进行统计分析，P＜0.05 时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素在小鼠体内抑制VSV 病毒感染 为了探索紫草素对小鼠病毒感染的影响，记录了VSV 病毒感染后96 h 小鼠的生存率。在感染VSV 病毒后，对照组小鼠在12 h 开始死亡。相比之下，通过腹腔注射紫草素可以延长小鼠的存活时间并提高其生存率（20 mg/kg时为40%，40 mg/kg时为70%）（图1A）。随后，发现接受紫草素处理的小鼠肝、脾和肺组织中的VSV滴度和VSV-G mRNA水平明显降低（图1B、C）。H&E 组化实验结果表明，VSV 病毒感染小鼠在紫草素处理后其肺组织结构的损伤和炎症细胞的浸润与对照组相比明显减少（图1D）。

图1 紫草素在小鼠体内抑制VSV病毒感染Fig.1 Shikonin inhibits VSV infection in mice

2.2 紫草素在小鼠体内促进Ⅰ型干扰素的产生Ⅰ型干扰素在抗病毒天然免疫反应中发挥着关键作用，因此本研究探讨紫草素是否会影响Ⅰ型干扰素的产生。VSV 感染的小鼠，经紫草素处理后小鼠外周血中IFN-β 浓度与对照组相比显著升高（图2A），而IL-6 的浓度没有明显差异。评估小鼠肝、脾和肺组织中 IFN-β 的表达，发现 20 mg/kg 和40 mg/kg 的紫草素均能够增加肝、脾和肺组织中IFN-β的表达（图2B）。以上结果表明紫草素特异性增强小鼠RNA病毒感染中IFN-β的产生。

图2 紫草素在小鼠体内促进Ⅰ型干扰素的产生Fig.2 Shikonin enhances production of type Ⅰinterferon in mice

2.3 紫草素抑制巨噬细胞中VSV 病毒的感染IFN-β 主要由巨噬细胞产生，为了进一步明确紫草素在病毒感染中的作用，用不同浓度的紫草素预处理巨噬细胞后并用VSV 病毒感染，发现低剂量（0.5 μmol/L）和高剂量（1 μmol/L）的紫草素均能降低VSV 病毒滴度（图3A、B）。使用不同浓度的VSV（MOI=0.1 和1）感染巨噬细胞，结果显示紫草素均能显著抑制VSV-G mRNA 表达（图3A、B）。随后，用带绿色荧光的GFP-VSV 感染细胞，通过流式检测发现紫草素处理能够显著降低细胞GFP-VSV 的感染（图3C）。这些数据表明紫草素能够抑制巨噬细胞中VSV病毒的感染。

图3 紫草素抑制巨噬细胞中VSV病毒的感染Fig.3 Shikonin inhibits VSV infection in macrophages

2.4 紫草素能够促进Ⅰ型干扰素的表达从而抑制VSV 病毒的感染 为了进一步验证紫草素对病毒的抑制作用是否由Ⅰ型干扰素介导，在体外检测Ⅰ型干扰素和炎症因子的产生。在VSV 感染不同时间点，观察到紫草素处理后能够显著促进IFN-α和 IFN-β mRNA 的表达，而 TNF-α mRNA 没有明显差异（图4A）。用不同浓度的病毒感染后，在紫草素作用下，均能增强IFN-α 和IFN-β mRNA 的表达（图4B）。ELISA 结果表明 VSV 病毒感染后，IFN-β 蛋白水平在紫草素处理后能够显著增加，然而TNF-α 表达却没有明显变化（图4C）。利用Ⅰ型干扰素受体的阻断抗体（IFNAR1 Ab）来阻断Ⅰ型干扰素的信号通路，发现紫草素并不能抑制VSV 病毒的扩增和复制（图4D、E）。上述结果表明，紫草素能够促进Ⅰ型干扰素的表达从而抑制VSV病毒的感染。

图4 紫草素能够促进Ⅰ型干扰素的表达从而抑制VSV病毒的感染Fig.4 Shikonin inhibits VSV infection by promoting production of type Ⅰinterferon

2.5 紫草素促进VSV病毒诱导转录因子IRF3的活化 Western blot 结果表明，紫草素处理不会显著调控p38、ERK、JNK、p65 和TBK1 的磷酸化，但可以显著促进IRF3的磷酸化（图5）。上述数据表明紫草素通过上调IRF3活化来促进IFN-β产生。

图5 紫草素促进VSV病毒诱导转录因子IRF3的活化Fig.5 Shikonin promotes activation of IRF3 induced by VSV infection

3 讨论

近期临床研究显示，中药在新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起COVID-19的治疗中发挥着重要作用［15-16］。莲花清瘟已被国家卫生健康委批准用于COVID-19 的治疗［17］。本研究也证明了中草药紫草素在小鼠体内和体外均能抑制VSV 病毒感染。因此，推测紫草素也可能抑制SARS-CoV-2的感染。

以往研究发现，紫草素具有抑制炎症、抗氧化以及抑制凋亡的作用［18-19］。在一些与炎症和肿瘤相关的疾病中，紫草素可以通过抑制炎症因子的释放和氧化应激来减轻疾病的严重程度，如糖尿病视网膜病变以及乳腺癌、宫颈癌等［9，12-13］。本研究使用VSV 病毒来探究紫草素在宿主抗病毒中的作用，结果表明，紫草素可以在体内和体外保护宿主，抑制RNA 病毒感染，并且证明紫草素是通过上调巨噬细胞IFN-β来抑制病毒入侵。

以往研究发现紫草素能够通过多种机制发挥其作用。如紫草素能够抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路从而抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡［20］。紫草素能够上调 P38、ERK 和 JNK 磷酸化，从而促进凋亡相关蛋白PARP 和Caspase-3 的表达，促进肿瘤细胞凋亡［21］。此外，紫草素也能够诱导ROS 聚集，促进肿瘤细胞凋亡［22-23］。紫草素还能通过抑制TLR4 的表达抑制NF-κB 的信号通路，抑制炎症因子的产生［24］。有文献报道紫草素通过活化PI3K/AKT 信号通路缓解心肌缺血/再灌注损伤中的心肌细胞损伤［25-26］。本研究发现紫草素在病毒感染巨噬细胞后，能够显著上调转录因子IRF3的磷酸化水平，而没有显著改变NF-κB 信号通路的活化。IRF3 是Ⅰ型干扰素的关键转录因子。因此，紫草素是通过促进IRF3的活化，促进Ⅰ型干扰素的表达和抗病毒作用。尚需进一步研究紫草素对其他类型细胞的影响，包括除巨噬细胞外的其他天然免疫细胞、适应性免疫细胞、组织结构细胞等。

综上所述，本研究结果显示紫草素可以通过增强IRF3 活化，促进Ⅰ型干扰素的表达，来抵抗VSV病毒感染。结果表明紫草素是一种优秀的、潜在的抗病毒候选药物。