miR-100靶基因BAZ2A在肝癌迁移侵袭中的机制研究①

李首庆 米旭光 刘 磊 马寅芙 魏海峰 方艳秋 （吉林省人民医院中心实验室，长春 130021）

肝癌是高发、高转移且致死性高的恶性肿瘤，寻找miRNA 与肝癌转移之间的机制是攻克肝癌发展转归的研究方向之一。miR-100 参与抑制多种肿瘤的增殖和耐药性［1-4］。溴结构区邻近至锌指结构区蛋白 2A 即 BAZ2A 基因（bromodomain adjacent to zinc finger domain 2A），可能在转录调控中发挥作用。本研究的前期工作中发现BAZ2A 基因在肝癌细胞中高表达，且BAZ2A 受到miRNAs 的直接或间接调控，这些机制可能是研究肿瘤发展转移和治疗的新契点。BAZ2A 为miR-100 的靶基因之一，本研究旨在探讨在肝癌转移过程中miR-100对于BAZ2A的作用及机制，从而进一步对肝癌的诊疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402、人正常肝细胞HL-7702 和人肾HEK293T 细胞为本实验室冻存。胎牛血清、RPMI medium 1640（GIBCO，美国）；RT-PCR 试剂盒（Promega，美国）；SYBR Green Master（Roche，瑞士）；Trizol、LipofectamineTM2000（Life Technologies，美国）、Matrigel（Sigma，美国）；质粒小量提取试剂盒（Axygen，美国）；Has-miR-100 mimics及阴性对照（上海百奥迈科，中国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养使用含10%FBS 和双抗的RPMI1640培养基。细胞培养条件为37℃、5%CO2和100%饱和湿度的细胞培养箱。细胞密度达到约90%时进行传代培养。

1.2.2 总RNA提取和qRT-PCR检测 选取细胞状态好的人肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402和人正常肝细胞HL-7702 进行RNA 提取（Trizol 法），以核酸分析仪测定提取的RNA 浓度和纯度。按逆转录说明书将1 μg RNA 逆转录为cDNA。再进行PCR 反应并电泳分析。

1.2.3 脂质体转染及细胞总RNA 提取 肝癌细胞SMMC-7721 密度达到约90%时，将细胞转至6 孔板（2×105个/孔），miR-100 mimics 5 μl（终 浓 度 为50 nmol/L）以 LipofectamineTM2000 5 μl 转染肝癌细胞SMMC-7721，转染48 h 后，收集转染细胞和对照细胞，进行细胞RNA 提取和蛋白提取用于后续实验。（注：构建的BAZ2A 高表达重组质粒pcDNA3.1-BAZ2A转染方法）。

1.2.4 qRT-PCR 检测 qRT-PCR 检测转染细胞中miR-100 和 BAZ2A 基因的表达量。miR-100 表达以U6 作为内参，BAZ2A 表达以 GAPDH 为内参。结果以2-ΔΔCt表示mRNA拷贝数比值。

1.2.5 Western blot 1.2.3 中的转染细胞及对照细胞用细胞裂解液重悬，离心取上清后，进行蛋白浓度分析。蛋白上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜，封闭，酶标仪检测，拍照。

1.2.6 荧光素酶活性检测 以DNA 寡核苷酸退火缓冲液（Annealing Buffer 5×）用于BAZ2A 3'UTR 引物序列及突变引物序列BAZ2A 3'UTR-mut 的退火。PCR 反应结束后产物直接与pmirGLO 荧光质粒4℃连接过夜。转化后提取连接质粒（pmir-BAZ2A 3'UTR、pmir-BAZ2A 3'UTR-mut）用于荧光素酶活性检测。将miR-100 mimics（终浓度50 nmol/L）与构建的pmirGlo 系列质粒（终浓度300 ng/孔）、内参β-半乳糖苷酶（β-gal，30 ng/孔）共转染 HEK293T 细胞（12 孔板），同时设NC 及 pmirGlo 空质粒对照组，且每组3 个复孔，制备细胞裂解液；取96 孔荧光素检测白板，每孔加入5 μl 荧光素酶分析缓冲液（Assay cocktail），将 45 μl 细胞裂解液加入对应检测孔中，混匀（避免气泡产生）；放入荧光免疫分析仪后，每孔加入100 μl荧光素反应液，直接启动程序检测活性。

1.2.7 miR-100对肝癌细胞增殖迁移能力的影响SMMC-7721 细胞悬液接种6 孔板，次日细胞密度达60%～70%进行细胞转染，设阴性对照组，分别于划痕0 h、24 h、48 h 进行细胞迁移拍照，以软件统计划痕处细胞迁移的宽度，量化图统计分析细胞迁移差异。

1.2.8 Transwell 小室侵袭及迁移实验 4℃过夜融化Matrigel，并用预冷的不含血清的DMEM 培养基按1∶3 稀释 Matrigel，使其终浓度达到 1 mg/ml；将Transwell 小室放置于 24 孔板上，并加入 100 μl 稀释的Matrigel，37℃ 孵育1 h 使胶完全凝固（注：侵袭实验需此步固化小室，迁移实验略过此步）。加入5×104个肝癌细胞 SMMC-7721 100 μl（5%FBS 培养基制备）于小室上室中，并加600 μl含10%FBS 的培养基于Transwell 的下室，孵育48 h 后，洗涤，染色，将小室置于显微镜下观察并拍照。

1.2.9 BAZ2A 真核基因表达载体的构建 以肝癌细胞SMMC-7721 提取RNA 逆转录生成的cDNA 为模板，建立PCR 扩增体系，PCR 产物凝胶回收后，BamHⅠ与XbalⅠ双酶切，回收酶切产物与同样经双酶切的pcDNA3.1回收产物连接构建BAZ2A高表达重组质粒pcDNA3.1-BAZ2A。

1.3 统计学分析 实验数据以SPSS17.0统计软件进行处理。实验组间统计分析采用配对t检验。统计结果认定P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌细胞miR-100 水平定量检测 提取细胞RNA，采用荧光定量PCR 法检测肝癌细胞中miR-100 的表达水平，人正常肝细胞HL-7702 做参照。结果显示（图1），相对于正常肝细胞，miR-100 在肝癌细胞中表达减少，尤其在肝癌细胞SMMC-7721中。

图1 miR-100在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达差异Fig.1 Expression of miR-100 in liver cancer cells and normal hepatocytes

2.2 miR-100 对 BAZ2A 表 达 的 影 响 miR-100 mimics 50 nmol/L 转染肝癌细胞 SMMC-7721 48 h 后（设置阴性对照NC），通过qRT-PCR 检测发现，miR-100表达显著升高（P＜0.01，图2A），而BAZ2A mRNA表达水平明显降低（P＜0.05，图2B）。Western blot分析结果显示，miR-100 表达增高的情况下，BAZ2A表达越降低（图2C）。

图2 miR-100 mimics转染肝癌细胞SMMC-7721对BAZ2A表达影响Fig.2 Effect of miR-100 mimics transfection on BAZ2A expression in hepatocellular carcinoma cells SMMC-7721

2.3 BAZ2A 是miR-100 的靶基因检测 miR-100与BAZ2A 3'UTR 有结合位点，将荧光重组质粒与miR-100 mimics 共转入HEK293T 细胞中，检测细胞的荧光素酶活性。结果显示（图3），转染miR-100 mimics组pmir-BAZ2A 3'UTR 荧光素酶活性较NC 组明显降低（P＜0.05），而pmir-BAZ2A 3'UTR-mut荧光素酶活性miR-100 mimics 组与NC 组差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 荧光素酶报告基因实验检测miR-100 与BAZ2A 3'UTR的结合能力Fig.3 Luciferase activity detected for binding capacity of miR-100 and BAZ2A 3'UTR

2.4 miR-100 对肝癌细胞迁移能力的影响 细胞划痕实验显示（图4），SMMC-7721 细胞转染miR-100 mimics 50 nmol/L 24 h 后，肝癌细胞的迁移水平与阴性对照（NC）组相比有所下降（P＜0.05），且48 h后下降更为明显（P＜0.01）。miR-100 表达增强，BAZ2A的表达被抑制，肝癌细胞的迁移能力减弱。

图4 miR-100对SMMC-7721细胞迁移能力影响Fig.4 Effect of miR-100 on SMMC-7721 cells migration

2.5 上调SMMC-7721 细胞中miR-100 的表达对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响 肝癌细胞SMMC-7721转染miR-100 mimics 50 nmol/L 48 h后，Transwell小室侵袭及迁移实验结果显示（图5A、B），转染组肝癌细胞的迁移侵袭数目明显减少（P＜0.01）。在肝癌细胞中上调miR-100 的表达，可以明显抑制肝癌细胞的迁移侵袭能力。

图5 肝癌细胞株SMMC-7721转染miR-100 mimics后细胞迁移侵袭实验Fig.5 Migration and invasion of hepatoma cell line SMMC-7721 transfected with miR-100 mimics

2.6 BAZ2A 高表达可以对抗miR-100 对肝癌细胞的抑制作用 以上实验结果显示，在肝细胞中，miR-100 表达增高可以发挥抗肿瘤作用，且BAZ2A作为miR-100 的靶基因，实验验证当高表达BAZ2A是否可以使miR-100 的抑癌作用减弱。将BAZ2A真核基因表达载体pcDNA3.1-BAZ2A 与miR-100 mimics 共转入SMMC-7721 细胞中，划痕和迁移侵袭实验结果显示（图6），在转染后48 h，miR-100 明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭作用的同时（P＜0.01），加入BAZ2A 真核基因表达载体组的细胞迁移和侵袭能力均得以恢复，且与miR-100 转染组有显著性差异（P＜0.01）。综上所示，miR-100 对肝癌细胞的迁移和侵袭能力的抑制可以体现在对靶基因BAZ2A的表达抑制。

图6 肝癌细胞株SMMC-7721 共转染miR-100 mimics 和BAZ2A cDNA后细胞迁移侵袭实验Fig.6 Migration and invasion of hepatoma cell line SMMC-7721 transfected with miR-100 mimics and BAZ2A cDNA

3 讨论

肝癌早期诊断难，晚期治疗效果差，患者预后不佳，生存率低。深入了解肝癌发生发展的分子机制，寻找新的治疗靶点是肝癌研究方向之一。研究表明，miRNAs 参与了肿瘤发生发展调控，miRNAs和其调控的靶基因在肝癌发展中的作用机制是肝癌研究的重要方面。

本研究前期工作中，研究者就6 种miRNA 靶基因在3 种肝癌细胞中的表达进行研究，筛选出3 种肝癌细胞中高表达基因，其中以BAZ2A 基因表达最高，目前研究资料显示BAZ2A 是多种miRNAs 的靶基因，参与胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌等肿瘤的发生转移机制中［5］。miRNA 通常与靶基因 mRNA 3'UTR区发生相互作用，进而关闭或抑制基因的表达。本研究通过TargetScan 筛选可与BAZ2A 基因 3'UTR结合，且在肝癌的发生转移机制中发挥重要作用的关键miRNAs，研究在肝癌细胞中miRNAs 及其靶基因BAZ2A 的表达变化对肝癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响，进而研究BAZ2A 基因在肝癌发生转移中的作用和机制。筛选结果显示，miR-100 可与BAZ2A 基因 mRNA 的 3'UTR 有一处结合位点，序列为UACGGGU。资料表明，miR-100可表现抑癌基因的作用，在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌和肺癌等多种肿瘤的发生发展中起到重要作用，还能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［6-13］。miR-100 可调控在肝癌中高表达的BAZ2A 基因，miR-100 有望成为肝癌治疗的新靶点及预测预后的新分子标记。

综上所述，以肝癌中高表达的靶基因BAZ2A，反向筛选出肿瘤特异性的miRNA，通过荧光定量法验证所选miR-100 在肝癌细胞中的表达，荧光素酶活性检测法验证了miR-100 对靶基因BAZ2A 的作用。一方面，过表达miR-100 可抑制BAZ2A 在肝癌细胞中的表达水平，同时削弱肝癌细胞的生长，迁移和侵袭能力，另一方面，BAZ2A 过表达也使miR-100 在肝癌细胞中的抗肿瘤作用得以部分恢复。在肝癌细胞中上调miR-100的表达可以通过直接抑制BAZ2A 的表达而影响肝癌细胞的迁移侵袭。后续实验将开展研究miRNA inhibitor和干扰肿瘤中靶基因表达对肿瘤迁移侵袭的作用。