基于代谢组学研究痰热内扰型慢性失眠病人血清代谢物及中药干预作用

李文慧，朱陵群，郭蓉娟

慢性失眠以夜间失眠和日间功能损害为主要特征，失眠症状常表现为入睡困难、睡眠维持障碍、早醒、醒后难以再次入睡，甚则彻夜不眠，日间症状包括疲劳、情绪不稳、周身不适、认知功能减退等，且上述症状持续≥3个月[1-2]。慢性失眠属于中医学“不寐”范畴，痰热与痰浊导致的阴阳不和形成的失眠最为常见[3]，临床研究表明，痰热内扰证是不寐最常见的证型之一，黄连温胆汤是治疗不寐痰热内扰证的经典方剂，具有良好的疗效与安全性[4-7]。在符合失眠症诊断的病人中，31%～75%为慢性失眠，其中66.67%以上的病人病程>1年[8]。长期失眠可导致焦虑、抑郁、高血压、冠心病、糖尿病、肿瘤等疾病，全面深入剖析其发病机制并对其有效防治至关重要。

失眠的发病机制十分复杂，有过度觉醒机制、神经-内分泌-免疫机制、相关脑区及神经递质机制等[9]，由于大脑结构的特殊性及神经生物学的复杂性，其发病机制的研究受到限制。代谢组学的日益发展，为失眠的诊断、阐明发病机制、治疗监测、药物研发等提供了思路，其整体性和系统性的分析思想与中医整体观念不谋而合，因此，特别适用于中医药领域的研究。目前，关于慢性失眠的代谢组学研究很少，已有的研究以动物实验为主，且人体代谢环境比较复杂，因此，临床代谢组学研究尤为重要。由于男女存在显著代谢差异，故本研究对男性和女性分别进行检测分析，最后整合分析共同变化趋势的代谢物质，以期减小误差，提高研究结果的可靠性。

1 资料与方法

1.1 病例来源 选取2019年8月—2020年12月自愿参加本研究的痰热内扰型慢性失眠病人36例作为慢性失眠组，选取同期健康受试者36名作为健康对照组，其中，慢性失眠组脱落3例，最终纳入33例。慢性失眠组给予黄连温胆汤免煎颗粒(组方：黄连、法半夏、竹茹、橘红、麸炒枳实、茯神、甘草、生姜、大枣，由江阴天江药业有限公司生产)，每日1剂，上下午分服，治疗4周。健康对照组不予干预。本研究经中医临床基础医学研究所伦理委员会批准，所有研究对象对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 慢性失眠纳入标准：符合慢性失眠西医诊断标准[10]和中医证候诊断标准[11]；Spiegel睡眠问卷总分≥9分；年龄18～70岁。健康对照组纳入标准：无睡眠障碍、严重精神疾病及其他器质病变；年龄18～70岁；签署知情同意书者。

1.2.2 排除标准 不符合纳入标准者；焦虑自评量表(SAS)评分≥50分，贝克抑郁自评问卷(BDI)评分≥14分，患有精神分裂症和其他严重精神障碍者；其他继发性失眠者或躯体疾病引发失眠者(如脑卒中后、帕金森病等)；妊娠或哺乳期妇女，或在接受治疗过程中准备妊娠者；合并糖尿病、肝肾功能异常、免疫性疾病、代谢综合征。

1.3 仪器与试剂 Q EXACTIVE液质联用系统购自美国Thermo公司，ACQUITY BEH C18色谱柱购自美国Thermo公司，Millipore-Q超纯水系统购自美国Millipore公司，DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪购自美国DIONEX公司，离心机购自德国Eppendorf公司，移液枪购自德国Eppendorf公司，涡旋混合仪购自美国Thermo公司，超低温冰箱购自美国Thermo公司，液相色谱-质谱联用(LC/MS)级乙腈购自德国Merck公司，HPLC级甲醇购自德国Merck公司，甲酸购自德国CNW公司。

1.4 血清样本采集与保存 于治疗前后采集清晨空腹静脉血5 mL置于真空采血管中，静置30～60 min 后，4 ℃、3 000 r/min离心10 min。离心后取上清1 mL装于EP管中，登记样本信息后置于-80 ℃冰箱冻存备用，以进行代谢组学检测。

1.5 液相色谱-质谱(LC/MS)联用分析条件

1.5.1 色谱参数 仪器名称：DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪；色谱柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×50 mm；液相条件：水(含2 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸)，乙腈。梯度洗脱，分析时间0～18 min，进样量5 μL，流速0.25 mL/min。

1.5.2 质谱参数 仪器名称：Thermo Q EXACTIVE离子源。ESI(±)监测模式采用一级全扫描和二级数据依赖性扫描。离子源参数：电喷雾离子源ESI以正离子(ESI+)和负离子(ESI-)运行，ESI(-)喷雾电压为2 800 V；ESI(+)喷雾电压为3 500 V。蒸发温度：350 ℃；鞘气：35 Arb；辅助气：10 Arb；毛细管温度：320 ℃；S-lens RF：50。一级全扫描：分辨率为70 000，AGC target为1e6，Maximun TT为100 ms，扫描范围为70～1 050 m/z。二级数据依赖性扫描：分辨率为35 000，AGC target为1e5，Maximun TT为50 ms；NCE：20 V、40 V、60 V。

1.6 样本制备与检测 取血清样本50 μL加入450 μL沉淀剂(甲醇∶乙腈=1∶1)沉淀蛋白，涡旋混匀60 s后，4 ℃，10 000 r/min，离心10 min，取100 μL置于Thermo Q EXACTIVE液质联用系统中进行LC-MS/MS分析。

1.7 统计学处理 利用中国检验检疫科学研究院自建的Tracefounder软件对LC/MS数据进行预处理后，采用Metabo Analyst 4.0软件进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)构建预测模型和寻找代谢标志物，选择变量重要性投影(VIP)>1的代谢物作为主要的差异性内源代谢物，选择P>0.1的作为影响的主要代谢通路。

2 结 果

2.1 原始色谱图的可视化检查 对质量控制(QC)样品的总离子流色谱图(TIC)进行重叠，采用一级全扫描模式，分析细胞上清液，罗列出样本TIC图，如图1～图6所示，观察发现仪器的保留时间重现性非常好，仪器稳定。

图2 QC样本负总离子流色谱图

图3 正离子全扫描总离子流图

图4 负离子全扫描总离子流图

图5 赖氨酸色谱图

图6 赖氨酸相应的精确质量数和分子式

2.2 慢性失眠组与健康对照组对比分析

2.2.1 多元统计分析 为观察各组的分组聚类效果，将标准化后的数据进行PCA分析(见图7、图8)，慢性失眠组与健康对照组之间不完全重叠；再进行监督的PLS-DA模式识别(见图9、图10)，慢性失眠组与健康对照组完全分离，样本间呈现出良好的分类效果。

图7 男性PCA得分图

图9 男性PLS-DA立体图

图10 女性PLS-DA立体图

2.2.2 差异性代谢物 慢性失眠男性病人与男性健康受试者比较，共发现53个差异性代谢产物，其中28个代谢物质上升，25个代谢物质下降；女性慢性失眠病人与女性健康受试者比较，共发现48个差异性代谢产物，其中18个代谢物质上升，30个代谢物质下降。去除性别因素进行综合分析，与健康受试者比较，男性和女性慢性失眠病人血清中均上升的代谢物质有L-乙酰肉碱、L-亮氨酸、L-缬氨酸、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)[20∶3(5Z，8Z，11Z)]、LysoPC(17∶0)、组胺、磷脂酰胆碱(PC)[18∶1(9Z)/20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z)]；下降的物质有肌酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、鞘磷脂(SM)[d18∶0/18∶1(11Z)]、油酸、PC[18∶3(6Z，9Z，12Z)/16∶0]、二十二碳六烯酸(DHA)。

2.2.3 代谢通路 慢性失眠组男性病人代谢物质变化涉及的代谢通路有8条，分别是：D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代谢，组氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，色氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘油磷脂代谢；女性病人代谢物质变化涉及的代谢通路有4条，分别是：组氨酸代谢，鞘氨醇代谢，色氨酸代谢，甘油磷脂代谢。详见表1、表2。

表1 男性代谢通路分析结果

表2 女性代谢通路分析结果

2.3 黄连温胆汤治疗前后对比分析

2.3.1 多元统计分析 将标准化后的数据进行PCA分析，如图11、图12所示，各组样本间尚未完全分离；再做监督的PLS-DA模式识别，得到PLS-DA得分图见图13、图14，治疗后与健康组分离，治疗前后样本间尚未完全分离。

图11 男性PCA得分图

图12 女性PCA得分图

图13 男性PLS-DA立体图

图14 女性PLS-DA立体图

2.3.2 差异性代谢物 与治疗前比较，慢性失眠组男性病人经黄连温胆汤治疗后共发现30个差异性代谢产物，其中13个代谢物质上升，17个代谢物质下降；而女性病人经治疗后共发现39个差异性代谢产物，其中18个代谢物质上升，21个代谢物质下降。去除性别因素分析，经黄连温胆汤治疗后，男性和女性病人血清中均上升的物质有：LysoPC[18∶2(9Z，12Z)]、LysoPC[20∶4(8Z，11Z，14Z，17Z)]、LysoPC[18∶1(11Z)]、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、肌酸、L-色氨酸；下降的物质有：PC[16∶1(9Z)/20∶3(8Z，11Z，14Z)]、PC[16∶1(9Z)/22∶2(13Z，16Z)]、L-肉碱、SM[d18∶0/18∶1(11Z)]、PC[18∶1(9Z)/20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z)]、SM[d18∶0/16∶1(9Z)]、PC[o-16∶1(9Z)/20∶4(8Z，11Z，14Z，17Z)]、2-羟基丁酸、L-乙酰肉碱、SM(d18∶1/16：0)。

2.3.3 代谢通路 慢性失眠男性病人治疗前后代谢物质变化涉及的代谢通路有5条，分别是：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代谢，组氨酸代谢，色氨酸代谢，甘油磷脂代谢。女性病人治疗前后代谢物质变化涉及的代谢通路有3条，分别是苯丙氨酸代谢、鞘脂类代谢和甘油磷脂代谢。详见表3、表4。

表3 男性代谢通路分析结果

表4 女性代谢通路分析结果

3 讨 论

3.1 磷脂代谢分析 神经细胞由磷脂所构成的细胞薄膜包覆，在促进神经传导和大脑活动、增强记忆力、促进脂肪代谢等方面有重要作用。机体中主要含有甘油磷脂和鞘磷脂(sphingomyelin，SM)两大类磷脂，其中，甘油磷脂最主要的成分是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)。PC与人体内的神经传导物质有关，通过磷脂酶A2的催化作用降解为LysoPC，部分PC是炎症的重要生物标志物[12]。LysoPC作为趋化介质，可通过特异性G蛋白偶联受体对免疫细胞活化的修饰来参与炎症过程，有报道称LPC可作为肺炎的诊断和预后重要的评价指标[13]。SM、PC、LPC均含胆碱，胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶的催化作用下合成乙酰胆碱。乙酰胆碱不仅是与神经兴奋的传导、学习记忆密切相关的神经递质，而且与睡眠的调节密切相关[14]。乙酰胆碱是快速眼动睡眠调节模型中的关键成分[15]，而在睡眠早期，由于乙酰胆碱的减少，增加的慢波活性有助于运动记忆的巩固[16]。

从现代生物学视角来看，中医学中“痰”的物质基础以脂质代谢为主，“热”与炎症相关。在本研究中，慢性失眠病人血清差异性代谢物中，磷脂类代谢物数目最多，同时LysoPC、PC参与炎症过程，与病人表现出的痰热证症状相吻合。经黄连温胆汤干预后，慢性失眠病人血清内PC、LysoPC、SM等脂类物质发生改变，因此，黄连温胆汤通过调节脂质代谢发挥干预作用。

3.2 氨基酸代谢分析 色氨酸是一种可通过血脑屏障的必需氨基酸，分为L-色氨酸和D-色氨酸，D-色氨酸不能被生物体利用。体内色氨酸代谢异常，会引起神经系统的功能障碍，导致失眠的发生[17]。作为最重要的神经递质之一的5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，是由色氨酸在色氨酸羟化酶及五羟色氨酸脱羧酶的作用下生成的。5-HT在大脑皮层和神经突触内含量最多，能维持慢波睡眠，同时5-HT能神经元可促使具有催眠效应的肽类物质的累积[18-19]。研究显示，给SD大鼠注射氯苯丙氨酸混悬液复制失眠模型，1周后大鼠外周血清5-HT含量明显下降，然而单独使用5-羟色氨酸后，可产生催眠作用[20-21]。本研究结果呈现慢性失眠病人色氨酸水平下降，可能导致5-HT合成减少，从而产生睡眠障碍。

苯丙氨酸属芳香族氨基酸，具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸，苯丙氨酸在苯丙氨酸羟化酶的催化下形成酪氨酸，并与酪氨酸一起合成与失眠密切相关的神经递质多巴胺(dopamine，DA)和去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)。中脑边缘多巴胺系统具有调控兴奋和镇静的双重作用，失眠障碍病人存在脑内多巴胺D2神经递质系统异常，睡眠相关多巴胺神经通路包括伏隔核、尾状核、壳核，多巴胺D2受体结合力降低，且多巴胺D2受体结合力下降与失眠障碍病程相关[22]。当双侧蓝斑尾部受损时，NE分泌明显减少，快速眼动睡眠完全不能进行，导致睡眠障碍[23]。本研究中慢性失眠病人苯丙氨酸较健康受试者降低，可能使多巴胺、NE的合成减少，从而影响睡眠。

缬氨酸、亮氨酸均是生糖氨基酸，可以通过代谢转变为葡萄糖为机体提供能量，同时二者作为支链氨基酸，可以增加肌肉量、缓解疲劳。与健康对照组比较，慢性失眠病人血清代谢物中缬氨酸、亮氨酸升高，可能是机体的代偿反应所导致，还需进一步研究。

综上所述，慢性失眠病人存在显著的氨基酸代谢紊乱，经黄连温胆汤治疗后，苯丙氨酸、色氨酸水平上升，说明黄连温胆汤可通过调节氨基酸代谢发挥干预作用。

3.3 能量代谢分析 肌酸广泛分布于大脑、心肌等组织中，当体内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)充足时，可在肌酸磷酸激酶的作用下促使ATP中的高能磷酸键基团转移到肌酸分子中形成磷酸肌酸。磷酸肌酸是脑、神经等组织储能的主要形式，肌酸可以通过稳定线粒体过渡孔，并且通过增加谷氨酸重摄取起神经保护作用[24]，可见磷酸肌酸和肌酸在脑能量代谢中发挥十分重要的作用。研究表明，失眠病人脑内肌酸浓度降低[25]。本研究中，慢性失眠病人血清代谢物肌酸水平降低，表明机体能量代谢发生异常，或可解释慢性失眠病人出现大脑昏沉不清、精神状态差等日间症状。

肉碱作为有机酸和脂肪酸的中间代谢产物，广泛存在于骨骼肌、心肌等组织中。肉碱有两个立体异构，包括有生物活跃的L-肉碱及其非生物活跃的对映异构体D-肉碱。L-肉碱是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，能够促进脂肪酸进入线粒体氧化分解。L-乙酰肉碱是L-肉碱的乙酰化形式，L-乙酰肉碱可以提供一个乙酰基部分，被氧化产生能量，用作乙酰胆碱的前体，或被并入谷氨酸、谷氨酰胺和γ-氨基丁酸，或被并入脂质，用于髓鞘形成和细胞生长[26-27]。可见，L-肉碱和L-乙酰肉碱在促进脂肪代谢和能量产生的过程中发挥着重要作用。本研究结果显示，无论是男性病人还是女性病人，L-乙酰肉碱水平均上升、肌酸水平下降，提示慢性失眠病人体内存在能量代谢障碍，脂肪酸代谢供能增加。经黄连温胆汤干预后，慢性失眠病人血清内L-乙酰肉碱及L-肉碱下降，肌酸水平上升，因此，黄连温胆汤通过调节能量代谢发挥干预作用。

3.4 脂肪酸代谢分析 油酸是一种单不饱和脂肪酸，与氨经脂肪酸酞胺水解酶催化合成油酰胺，其具有催眠活性，其在脑中含量与睡眠周期密切相关，缺乏睡眠时浓度增加，恢复睡眠时浓度减小[28-29]。DHA属于ω-3不饱和脂肪酸，在神经细胞中的浓度最高，因其对脑的发育具有重要作用，故称之为“脑黄金”。DHA具有促进神经细胞生长、改善认知功能、抑制氧化应激、提高免疫力等多种作用[30-32]，同时还能增强学习记忆能力[33]。海马是调控学习、记忆、情感等活动的重要脑区。陈超刚等[34]通过体外培养细胞试验对比发现，DHA促进海马神经细胞生长发育。本研究中，慢性失眠病人油酸和DHA下降，脂肪酸代谢异常，其中DHA下降，或可解释临床中慢性失眠病人出现记忆力下降、注意力不集中等认知障碍症状。

4 小 结

慢性失眠的发病机制很复杂，目前的研究多以局部或者靶点研究为主，仅从某一方面或单系统的研究往往不能解释整体现象。本研究基于代谢组学进行整体、系统的研究，为寻找痰热内扰型慢性失眠的生物标志物以及黄连温胆汤的治疗机制提供了一定的参考价值。经研究发现，痰热内扰型慢性失眠病人体内存在磷脂代谢、氨基酸代谢、能量代谢、脂肪酸代谢异常，经黄连温胆汤治疗后，血清代谢物L-苯丙氨酸、L-色氨酸、肌酸、L-乙酰肉碱及PC[18∶1(9Z)/20∶4(5Z，8Z，11Z，14Z)]回调，说明黄连温胆汤对痰热内扰慢性失眠干预作用与调节氨基酸代谢、脂质代谢、能量代谢有关。