红参调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路对人血管平滑肌细胞生物学过程的影响

黄达民，张金春，宋 蕾，岳冬梅，刘洪强，卢英民

动脉粥样硬化是促使心脑血管疾病发生的重要病理基础之一，动脉粥样硬化的发生率逐年升高，研究显示，血管平滑肌细胞增殖、迁移及炎症反应与动脉粥样硬化密切相关[1-2]。因而，积极探寻调控血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭的有效药物对心脑血管疾病的治疗具有重要意义。同型半胱氨酸(Hcy)可诱导血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭从而促进动脉粥样硬化的发生，因此，常采用Hcy诱导血管平滑肌细胞建立模型[3]。红参(red ginseng，RG)具有抗氧化作用，从而可减缓多种疾病的发展进程[4]。但红参对血管平滑肌细胞损伤的作用机制尚未明确。长链非编码RNA DARS-AS1(LncRNA DARS-AS1)在甲状腺癌等肿瘤中表达上调，并可促进肿瘤的发生及发展[5]。但DARS-AS1对血管平滑肌细胞损伤的作用机制尚未阐明。生物信息学分析显示，微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)可能是DARS-AS1的靶基因，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人血管平滑肌细胞中miR-125a-5p的表达下调，上调其表达可通过靶向调控(NLRP3)的表达从而抑制细胞增殖[6]。但红参是否可通过调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路而影响血管平滑肌细胞生物学行为尚未可知。因此，本研究采用Hcy处理人血管平滑肌细胞，探讨红参对细胞增殖、迁移及侵袭的影响，探究其对DARS-AS1/miR-125a-5p通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 红参购自上海齐一生物公司；人血管平滑肌细胞购自美国ATCC公司；Hcy与四唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；反转录与荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；DARS-AS1小分子干扰RNA(DARS-AS1 siRNA，si-DARS-AS1)、siRNA阴性序列(si-NC)、miR-125a-5p mimics及mimic 阴性序列(miR-NC)购自广州锐博生物公司；pcDNA3.1购自上海柯雷生物公司；兔抗人CyclinD1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21抗体购自美国CST公司；二抗购自美国Abcam公司。

1.2 实验分组 ①红参提取液[7]：称量3 g红参样品，磨碎，加入20 mL水，超声提取30 min，室温条件下10 000 r/min离心10 min，收集3次提取液，使用0.22 μm滤膜过滤，加入培养基稀释成浓度5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的溶液。②血管平滑肌细胞接种于6孔板(5×104个/孔)，分别加入含有500 μmol/L Hcy的培养基处理24 h[8]，作为Hcy组。同时将正常培养的细胞作为Control组。分别加入含有5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的红参提取液与500 μmol/L Hcy的培养基处理24 h，分别作为Hcy+RG-L组、Hcy+RG-M组、Hcy+RG-H组。后续实验设置Hcy+si-NC组(si-NC转染至血管平滑肌细胞，加入含有浓度为500 μmol/L Hcy的培养基处理24 h)、Hcy+si-DARS-AS1组(si-DARS-AS1转染至血管平滑肌细胞，加入含有浓度为500 μmol/L Hcy的培养基处理24 h)、Hcy+RG-H+pcDNA组(pcDNA转染至血管平滑肌细胞，加入含有浓度为20 mg/mL 红参提取液与500 μmol/L Hcy的培养基处理24 h)、Hcy+RG-H+pcDNA-DARS-AS1组(pcDNA-DARS-AS1转染至血管平滑肌细胞，加入含有浓度为20 mg/mL 红参提取液与500 μmol/L Hcy的培养基处理24 h)。

1.3 观察指标检测

1.3.1 MTT法检测细胞增殖情况 在96孔板上接种血管平滑肌细胞(1×104个/孔)，按照MTT试剂盒说明书操作并检测细胞OD值。

1.3.2 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭情况 在Transwell小室(美国Corning公司)下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培养液；Matrigel基质胶包被(侵袭实验，迁移实验无需包被)上室后加入血管平滑肌细胞悬浮液150 μL，培养24 h后依次以多聚甲醛、0.1%结晶紫染液固定20 min、染色10 min，于显微镜下观察透过膜的血管平滑肌细胞数。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测细胞中DARS-AS1、miR-125a-5p表达水平 用1 mL Trizol裂解液提取血管平滑肌细胞中总RNA，按反转录试剂盒的说明进行RNA反转录，合成cDNA。qRT-PCR反应在StepOne Plus Real-time PCR系统上按照荧光定量PCR试剂说明书操作，通过2-ΔΔCt法计算DARS-AS1、miR-125a-5p表达。引物由上海生工公司制备。

1.3.4 双荧光素酶报告基因检测DARS-AS1与miR-125a-5p的靶向关系 构建野生型载体WT-DARS-AS1与突变型载体MUT-DARS-AS1，分别将miR-NC、miR-125a-5p mimics与WT-DARS-AS1、MUT-DARS-AS1共转染至血管平滑肌细胞，24 h后在双荧光素酶报告分析系统中测量血管平滑肌细胞的相对荧光素酶活性。

1.3.5 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表达 血管平滑肌细胞在蛋白裂解液中裂解，等量蛋白用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，随后将分离的蛋白凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，分别加入兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21一抗稀释液(均为1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，加入二抗稀释液(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，条带使用增强化学发光法可视化后用Image J软件分析。

2 结 果

2.1 红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖 与Control组比较，Hcy组细胞增殖率和CyclinD1蛋白水平升高，p21蛋白水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Hcy组比较，Hcy+RG-L组、Hcy+RG-M组、Hcy+RG-H组细胞增殖率和CyclinD1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且Hcy+RG-L组、Hcy+RG-M组、Hcy+RG-H组组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表1。

图1 Western Blot法检测CyclinD1、p21蛋白表达条带图

表1 红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖 (±s)

2.2 红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9蛋白表达 与Control组比较，Hcy组迁移及侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Hcy组比较，Hcy+RG-L组、Hcy+RG-M组、Hcy+RG-H组迁移、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，且Hcy+RG-L组、Hcy+RG-M组、Hcy+RG-H组组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图2、图3。

表2 红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞迁移及侵袭 (±s)

图2 红参抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞迁移及侵袭图

图3 各组MMP-2、MMP-9蛋白表达条带图

2.3 红参调控DARS-AS1、miR-125a-5p的表达 与Control组比较，Hcy组DARS-AS1的表达水平升高，miR-125a-5p的表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Hcy组比较，Hcy+RG-L组、Hcy+RG-M组、Hcy+RG-H组DARS-AS1的表达水平降低，miR-125a-5p的表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且Hcy+RG-L组、Hcy+RG-M组、Hcy+RG-H组组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 红参调控DARS-AS1、miR-125a-5p的表达 (±s)

2.4 干扰DARS-AS1表达抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭 Hcy+si-DARS-AS1组细胞增殖率及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平，迁移细胞数，侵袭细胞数比Hcy+si-NC组减少，p21蛋白表达水平比Hcy+si-NC组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4、图4。

表4 干扰DARS-AS1表达抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭及CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表达比较 (±s)

图4 干扰DARS-AS1表达后CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表达条带图

2.5 DARS-AS1靶向调控miR-125a-5p DARS-AS1与miR-125a-5p存在结合位点，详见图5。miR-125a-5p过表达能够降低WT-DARS-AS1的荧光素酶活性，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表5。DARS-AS1可负向调控miR-125a-5p的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表6。

图5 DARS-AS1与miR-125a-5p互补的核苷酸序列示意图

表5 双荧光素酶报告实验(±s)

表6 DARS-AS1靶向调控miR-125a-5p的表达 (±s)

2.6 DARS-AS1过表达可减弱红参对Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用 Hcy+RG-H+pcDNA-DARS-AS1组细胞增殖率和CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平，迁移细胞数与袭细胞数高于Hcy+RG-H+pcDNA组，差异均有统计学意义(P<0.05)，p21蛋白、miR-125a-5p水平低于Hcy+RG-H+pcDNA组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图6、表7。

图6 DARS-AS1靶向调控后CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表达条带图

表7 DARS-AS1过表达可减弱红参对Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及调控CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表达 (±s)

3 讨 论

红参在血管系统疾病等多种疾病中均具有一定治疗作用，可通过促进一氧化氮(NO)的合成及释放从而发挥舒张血管的作用[9]。红参提取物中红参皂苷还可抑制氧化应激反应从而保护神经细胞[10]。本研究结果显示，Hcy处理后血管平滑肌细胞增殖能力增强，并可促进CyclinD1表达及抑制p21表达，而不同浓度的红参处理后血管平滑肌细胞增殖能力降低，并可抑制CyclinD1表达及促进p21表达。研究表明，下调CyclinD1表达及上调p21表达可抑制血管平滑肌细胞增殖[11]，提示红参可抑制Hcy诱导的血管平滑肌细胞增殖，且呈剂量依赖性。血管平滑肌细胞迁移及侵袭与MMP-2、MMP-9表达密切相关[12]。本研究结果显示，Hcy处理后可促进细胞迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9表达，而不同浓度的红参可抑制细胞迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9的表达。

本研究结果显示，Hcy诱导的血管平滑肌细胞中DARS-AS1的表达水平明显升高，而不同浓度的红参处理后DARS-AS1的表达水平明显降低，提示红参可能通过调控DARS-AS1的表达从而影响血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭。研究指出，DARS-AS1在卵巢癌中表达水平升高，并可能通过靶向调控miR-532-3p从而促进卵巢癌的发生及发展[13]。本研究结果显示，干扰DARS-AS1的表达使Hcy诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭能力减弱，提示DARS-AS1可促进Hcy诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭。本研究证实DARS-AS1可靶向结合miR-125a-5p。Hcy诱导的血管平滑肌细胞中miR-125a-5p的表达水平降低，而不同浓度的红参处理后miR-125a-5p的表达水平升高，提示红参可能通过上调miR-125a-5p的表达从而参与动脉粥样硬化的发生过程。研究表明，干扰LnRNA MEG3 表达可能通过上调miR-125a-5p 的表达从而抑制血管平滑肌细胞的增殖[14]。miR-125a-5p通过靶向ETS-1调节血管平滑肌细胞的表型转换[15]，提示红参可能通过下调DARS-AS1的表达靶向调控miR-125a-5p来调节血管平滑肌细胞的生物学过程。

综上所述，红参可抑制Hcy诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭，其作用机制与下调DARS-AS1的表达及上调miR-125a-5p的表达有关，DARS-AS1过表达可逆转红参对Hcy诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭的作用，进一步证实红参是通过抑制DARS-AS1而促进miR-125a-5p的表达来发挥作用，DARS-AS1可能为动脉粥样硬化治疗的潜在靶点，本研究为进一步阐释红参治疗动脉粥样硬化及心脑血管疾病的作用机制奠定了一定的实验基础。