不同周龄大鼠血管硬化程度与NF-κB 炎症信号通路的关系

朱红俊 陆曙 苏伟 龚少愚

(南京中医药大学无锡附属医院心血管科，江苏 无锡 214071)

对于非高危肺血栓栓塞症，年龄增长和疾病严重程度明显相关〔1〕；对于前列腺癌患者，不同年龄对疾病的不确定感和生活水平有显著差异〔2〕。对于动脉粥样硬化，年龄是独立的危险因素。动物年龄越大，其血管对高脂血症损伤也越敏感〔3〕。本研究从核因子(NF)-κB信号通路角度，探讨这种现象中炎症反应的相关机制，证实年龄对炎症信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 30只8周龄清洁级雄性SD大鼠由江苏省血吸虫病防治研究所动物实验中心提供和饲养，平均体重(220±20)g。分笼饲养，饲养环境:室温(22±4)℃,光照与黑暗循环时间为12 h。本研究均采用普通标准饲料喂养，由动物实验中心提供。

1.2实验试剂及仪器 20%乌拉坦及Invitrogen Trizol购自中国苏州碧丽雅生物科技有限公司；柱式细胞和组织总RNA抽提试剂盒购自中国上海博彩生物科技有限公司；淋巴细胞分离液购自中国北京生物技术研究所；无Ca、Mg的Hank液购自中国苏州科创生物技术有限公司；酶联免疫吸附试剂盒购自美国Blue Gene公司；LightCycler480聚合酶链反应(PCR)仪购自德国 ROCHE。

1.3分组与给药方法 所有大鼠采用标准饲料喂养，自由饮水。每周称大鼠体重。适应性喂养1 w后，剔除饲食异常者。在第9周龄、第13周龄、第21周龄，分别随机抽取10只大鼠，留取外周血、大动脉、心脏组织等实验标本。

1.4样品采集与预处理 取样时，采用20%乌拉坦腹腔注射麻醉。打开腹腔，从下腔静脉，采用5 ml无菌注射器抽取4 ml静脉血，分别注入生化管和85 U肝素锂抗凝的真空采血管各2 ml，根据试剂盒说明书进行外周血单个核细胞分离及RNA提取。留取大动脉(含升主动脉、主动脉弓、降主动脉)、心脏左心室(保留冠状动脉)心肌组织，0.9%生理盐水冲洗，分别置入含甲醛1 ml的2 ml冻存管(常温保存)及不含甲醛的2 ml冻存管，-80℃的冰箱保存待检。甲醛固定的大血管、左心室组织送至医院病理科进行取材、包埋。冰冻保存的组织样本根据试剂说明书进行组织匀浆制备及RNA的提取。

1.5指标检测 (1)外周血单个核细胞及左心室组织Toll样受体(TLR)-4 mRNA表达 根据文献方法〔4〕采用RT-PCR进行，通过溶解曲线、2%琼脂糖凝胶电泳和基因测序确定产物表达的准确性，TLR-4 mRNA的表达程度采用相对定量计算，以13周龄大鼠检测值为标准。标准化比值计算公式采用2-△△Ct法〔5〕。检测方法：管家基因β-actin作为内参基因，大鼠目的基因和内参基因引物序列：TLR-4正义链：5′-AGAATGAGGACTGGGTGA-3′,反义链：5′-AGCGGCTACTCAGAAACT-3′；β-actin正义链：5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′,反义链：5′-ACA TCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。(2)血清及左心室组织NF-κB水平、白细胞介素(IL)-6、IL-10水平 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。检测流程根据试剂说明书进行。(3)血脂水平 血脂〔总胆固醇(TC)、三酯甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)〕水平检测，由医院检验科采用氧化还原方法测定。

1.6组织学染色 (1)大鼠主动脉血管厚度 主动脉标本在主动脉弓根部取材，甲醛固定，石蜡包埋，连续切片5个，苏木素-伊红(HE)染色。镜下测量外膜基膜至血管内膜表面的最大垂直厚度。(2)左心室组织多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)-1的表达：采用免疫组化方法进行检测，检测方法参考文献〔6，7〕进行。每个标本在镜下随机观察相互不重叠的视野各4个，计算每个视野阳性细胞均数。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析及Pearson相关性检验。

2 结 果

2.1病理及免疫组化检测结果 大鼠主动脉壁厚度和PARP-1阳性细胞数随着大鼠周龄增加而增加(均P<0.05)。见图1，表1。

2.2NF-κB信号通路相关指标 大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB、血清IL-6水平随着大鼠周龄增加而增加(P<0.05)。大鼠外周血TLR-4 mRNA、血清NF-κB水平、血清IL-6水平均和大鼠周龄呈正相关(r=0.973，0.988，0.978，均P<0.05)。见表1。

2.3血脂水平 大鼠TC、LDL-C水平随着大鼠周龄增加而增加(P<0.05)。大鼠血脂TC、LDL-C水平和大鼠周龄呈正相关(r=0.992，0.994,均P<0.05)，见表1。

表1 不同周龄大鼠主动脉厚度与信号通路检测及炎症因子的检测结果

3 讨 论

年龄和多种疾病相关，年龄的增长可以在多个维度影响动脉粥样硬化的发生和发展。研究表明，随着年龄的增加，肥胖率降低而高血压患病率增加〔8〕。本研究结果表明，大鼠动脉粥样硬化程度与年龄相关。PARP和动脉粥样硬化、冠心病等病理过程中细胞程序性死亡有关〔9〕，并调节着多种炎症因子〔10〕的表达。而通过调控NF-κB来调节炎症反应是TLR-4调节炎症反应的主要机制之一。通过MyD88依赖和MyD88非依赖两条途径，TLR-4调节细胞内外信号传导，从而调控细胞内NF-κB的活性，介导下游IL-6等炎症因子的水平。

综上，大鼠年龄增长和动脉粥样硬化的NF-κB炎症信号通路之间具有紧密的相关性。