肉苁蓉多糖诱导Jurkat细胞凋亡作用

李岩 张谨 张竞男 闫思睿 马艳华 薛昕 徐宋瑶 李丽 扈瑞平 薛慧婷

(内蒙古医科大学 1基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2附属医院)

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种免疫表型高度异质性的淋巴系统恶性克隆性疾病，是临床上比较多发的白血病类型之一，ALL具有细胞突变快、易转移、细胞凋亡率低、易复发等特点〔1〕。目前常用治疗方法包括骨髓移植、诱导治疗、免疫治疗、联合化疗等〔2〕，由于多数化疗药物靶向杀伤肿瘤的能力有限，可能同时对消化系统、血液系统、心脑血管等造成严重损害，因此，患者在接受治疗的同时，往往会伴随较大的不良反应，其中一些甚至致命。随着化疗的进行，机体容易对化疗药物产生耐受，增加疾病复发的风险〔3，4〕。因此，寻找高效、低毒、靶向性强的白血病治疗或辅助治疗药物成为目前关注的焦点。肉苁蓉蒙语名为查干告亚，属于列当科、肉苁蓉属，寄生于沙漠树木的根部，有“沙漠人参”的美誉〔5〕。主要产区为内蒙古阿拉善盟，在新疆、甘肃等西北地区也有一定分布。肉苁蓉的主要活性成分包括苯乙醇苷、木脂素、甜菜碱、甾醇、氨基酸及多糖等〔6～8〕，具有润肠通便、补肾益精等作用，能提高性功能、抗疲劳、保肝、保护心脏、抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用〔5，9，10〕。研究发现，肉苁蓉多糖(CDP)作为其主要活性成分之一，具有抗肿瘤和免疫调节作用〔11，12〕。张涛等〔13，14〕发现CDP对白血病细胞K562、THP-1具有显著杀伤作用，并提示CDP在白血病预防或治疗过程具有一定作用。此外，在针对治疗急性白血病的中药复方中，肉苁蓉也作为重要组成成分之一而发挥作用。但肉苁蓉的具体作用机制尚未知晓。本文研究分离纯化CDP，探讨CDP对人急性白血病细胞系Jurkat的杀伤作用及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 肉苁蓉粉末购自内蒙古宏魁苁蓉集团有限责任公司，人急性白血病细胞系Jurkat购自上海细胞生物研究所细胞库，噻唑蓝(MTT)、十二烷基硫酸钠(SDS)购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、caspase-9、CD71、CD45、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司，actin抗体购自上海碧云天生物技术有限公司，电化学发光(ECL)底物购自美国Thermo Scientific公司，其他试剂均为国产分析纯。GelView 6000 plus智能图像工作站(广州博鹭腾生物科技有限公司产品)，Revolve FL正倒置荧光显微镜(美国Echo Laboratories公司产品)，EPOCH酶标仪(北京伯腾仪器有限公司产品)。

1.2CDP分离纯化 取肉苁蓉粉末500 g，95%乙醇浸泡过夜，利用纱布过滤，收集滤渣，60℃热水煮提，2 h/次，共3次。结束后，合并3次滤液，减压浓缩至原体积2/3，加入3倍体积95%乙醇，4℃静置过夜。次日，4 000 r/min离心10 min，收集沉淀，Sevag法除蛋白，无水乙醇沉淀后，冷冻干燥得CDP〔15，16〕。

1.3细胞培养 人急性白血病细胞系Jurkat实验室液氮中保存。使用时，37℃水浴锅中迅速复苏细胞，培养于10% FBS的RPMI1640培养基中(含有100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素)。在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，每隔2～3 d传代一次，待细胞进入对数生长期时，开展实验。

1.4MTT实验 取对数生长期的Jurkat细胞，离心获得细胞沉淀，计数5×105个/ml。取96孔细胞培养板，每孔接种100 μl细胞，再加入100 μl RPMI1640完全培养基作为对照组；实验组分为3组，先利用RPMI1640培养基配制不同浓度CDP，然后每孔加入100 μl Jurkat细胞和100 μl CDP溶液，使CDP最终浓度分别为1、2和5 mg/ml，每组设置5个复孔，于37℃细胞培养箱中孵育48 h。孵育结束后，每孔加入20 μl MTT(母液浓度为5 mg/ml)溶液，放回细胞培养箱中继续孵育4 h，最后加入100 μl 20% SDS 于37℃过夜溶解甲臜，次日利用酶标仪检测各组570 nm处的吸光值，利用公式分别计算不同浓度CDP对Jurkat细胞增殖的抑制率。

1.5Western印迹 取对数生长期的Jurkat细胞，以2×105个/ml的密度接种于6孔板中，500 μl/孔，对照组加入500 μl RPMI1640完全培养基。设置3个实验组，分别为1、2和5 mg/ml多糖处理组，CDP提前溶解于RPMI1640完全培养基中，于6孔板中加入500 μl细胞和500 μl 不同浓度CDP溶液，37℃条件下培养48 h。培养结束后，收集各组细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，获得细胞沉淀，利用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次。洗涤完毕后，每组加入20 μl细胞裂解液，于冰上裂解细胞30 min。提取总蛋白，采用Bradford〔17〕的方法调整细胞浓度。各组取20 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，经电转将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。利用脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入兔抗人caspase-3和caspase-9抗体，稀释比例1∶1 000，室温孵育1 h，经磷酸盐吐温缓冲液(PBST)摇床上漂洗3次(10 min/次)，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，利用PBST漂洗3次，PBS漂洗1次后，加入ECL底物，利用智能图像工作站成像，对比各组条带变化，研究CDP诱导Jurkat细胞凋亡作用。

对于凋亡通路相关蛋白的检测，细胞培养及CDP处理条件同上，反应结束后裂解细胞进行蛋白定量。通过SDS-PAGE和电转将蛋白转移至PVDF膜上，经脱脂奶粉封闭1 h后，分别加入抗CD71、CD45、p-JNK、p-ERK抗体(1∶1 000)，室温孵育1 h，利用HRP标记的二抗(1∶1 000)继续孵育1 h，最后利用智能图像工作站成像，研究CDP诱导Jurkat细胞凋亡的相关信号分子。所得实验条带用Image J(1.8.0)进行灰度分析。

1.6统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验和方差分析。

2 结 果

2.1细胞增殖水平 成功分离得到CDP，其中糖含量大于90%，蛋白质含量小于5%。1 mg/ml CDP组对细胞增殖的抑制率为(19.1±2.1)%，而2 mg/ml和5 mg/ml CDP组细胞增殖抑制率分别为(44.2±5.2)%和(47.8±4.4)%，说明CDP能够显著抑制Jurkat细胞的增殖，并呈剂量依赖性。

2.2细胞凋亡水平 与对照组(0.62±0.04、0.56±0.07)相比，5 mg/ml CDP处理Jurkat细胞后，导致caspase-9和caspase-3的酶原形式pro-caspase-9(0.09±0.02)和pro-caspase-3(0.12±0.01)大量减少，1 mg/ml和2 mg/ml CDP组对于细胞中pro-caspase-9(0.58±0.04、0.51±0.01)和pro-caspase-3含量(0.48±0.04、0.44±0.05)没有明显影响，即低浓度CDP不会诱导Jurkat细胞凋亡，以抑制细胞增殖为主，见图1。

1～4：对照组、1 mg/ml CDP组、2 mg/ml CDP组、5 mg/ml CDP组；下图同

2.3细胞凋亡受体 对照组CD71、CD45相对表达量为1.00±0.04、0.54±0.02。5 mg/ml CDP组能够显著抑制CD71(0.05±0.01)和CD45(0.13±0.03)的表达；1 mg/ml和2 mg/ml CDP组能够一定程度抑制CD71(0.52±0.06、0.43±0.07)的表达，而对CD45(0.51±0.01、0.48±0.02)的表达没有明显作用。见图2。

图2 CDP对细胞膜表面受体表达影响

2.4凋亡相关通路 对照组p-JNK、p-ERK相对表达量分别为1.20±0.08、0.21±0.03。5 mg/ml CDP组诱导细胞凋亡的同时，显著减少JNK的磷酸化水平(0.32±0.04)，显著增加ERK的磷酸化水平(1.13±0.05)；1 mg/ml、2 mg/ml CDP对JNK磷酸化水平(1.12±0.06、1.06±0.06)没有明显影响，但是仍会增加ERK的磷酸化水平(0.54±0.04、0.63±0.02)。见图3。

图3 CDP对JNK和ERK磷酸化的影响

3 讨 论

近年来研究发现CDP对于白血病细胞系具有一定的抑制作用，但是具体的作用机制尚未知晓。

细胞凋亡发生的过程中，caspase-9是caspase依赖性凋亡过程中的上游信号分子之一，正常状态下以酶原形式(pro-caspase)-9储存在细胞中，当细胞受到凋亡信号刺激后，pro-caspase-9被大量水解，产生活化形式的cleaved-caspase-9，继续向下传递凋亡信号，推动凋亡进程〔18〕。Caspase-3属于效应型caspase分子，是细胞caspase依赖性凋亡过程中的关键信号分子，正常状态下同样以酶原形式(pro-caspase-3)存在，一旦被水解激活，产生大量cleaved-caspase-3，则会裂解细胞中多种关键蛋白分子，最终诱导细胞凋亡〔19〕。CDP属于生物大分子活性多糖类物质，不能自由通过细胞膜进入细胞，因此CDP诱导细胞凋亡作用是通过影响Jurkat细胞膜表面受体的表达和分布，进而将信号传递到细胞内部，最终活化caspase家族蛋白，致使细胞最终发生凋亡。本研究说明低浓度CDP不会诱导Jurkat细胞凋亡，以抑制细胞增殖为主。

CD71又名转铁蛋白受体，是参与铁吸收和调节细胞生长发育的Ⅱ型跨膜糖蛋白受体，CD71在急性白血病患者体内高表达，且与原发性耐药相关，即CD71表达量越高，则首次化疗效果越差。因此，CD71是辅助诊断的标志物之一〔20〕。CD45表达于所有类型白细胞表面，又名白细胞共同抗原，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，与T细胞发育分化密切相关。CD45在不同种类白血病中的表达量和变构类型各异，因此可作为白血病鉴别诊断与免疫分型标志之一〔21〕。CD45单克隆抗体已大量用于白血病尤其是耐药型白血病的治疗研究中，Friesen等〔22〕发现放射性核素标记CD45单抗可通过激活caspase家族蛋白(包括caspase-3、caspase-8、caspase-9)诱导耐药白血病细胞株凋亡。CDP诱导Jurkat细胞凋亡，首先通过作用细胞膜表面受体CD45和CD71，影响二者的表达和分布，将凋亡信号传递到细胞内，最终激活caspase-9和caspase-3，引发凋亡。然而，caspase-9和caspase-3均位于凋亡通路的下游，而上游信号分子需要进一步探讨。本研究中CDP在浓度为5 mg/ml时，诱导Jurkat细胞凋亡，同时抑制CD45的表达，该作用与上述CD45单克隆抗体的作用类似。因此，从凋亡相关受体CD45与CD71的角度出发，CDP对于治疗或者辅助治疗白血病具有一定潜力。丝裂原活化蛋白激酶系统(MAPKs)表达于所有真核细胞中，是介导胞外刺激信号转导至胞内的十分重要的信息传递通路，由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成，包括ERK、JNK和p38MAPK，其磷酸化与去磷酸化作为细胞生命活动的开关，参与并调控细胞生长、增殖、分化、活化及凋亡等过程〔23～25〕。本研究提示，JNK去磷酸化参与CDP诱导T细胞凋亡，而ERK磷酸化参与CDP抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的两个过程。

综上，CDP对T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat具有细胞毒性作用，表现为低浓度(2 mg/ml以下)抑制细胞增殖，而高浓度(5 mg/ml)诱导细胞凋亡。CDP诱导Jurkat细胞凋亡主要通过影响和改变细胞膜表面凋亡相关受体CD71与CD45的表达，将信号传递到细胞内部，进一步引起ERK磷酸化和JNK去磷酸化，最终活化caspase-9，进而激活caspase-3导致细胞凋亡。